高效液相色譜-串聯質譜法同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素

王麗娟 ，柯潤輝 ，安紅梅 ，楊春艷 ，山樹棠 ，尹建軍

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司,北京100015； 2.國家食品質量監督檢驗中心,北京100015）

食品添加劑是現代食品工業中不可缺少的一部分，人工合成色素、甜味劑和防腐劑作為重要的食品添加劑被廣泛應用于食品生產加工[1-2]。但是，隨著其在食品行業的廣泛使用，違規及超限量使用事件時有發生，所帶來的食品安全問題也日益凸顯，安全監管問題已被列入食品安全整頓工作的重要內容[3-4]。隨著人們生活水平的提高及對健康的關注，葡萄酒慢慢取代了酒精度較高的白酒，成為了很多宴請和聚餐的“新寵”，消費量呈現日益增長的趨勢[5]，但葡萄酒市場仍有不少違法使用添加劑或者添加劑超標的現象，甚至有不法商販利用香精、色素、酒精、甜味劑等添加劑進行勾兌，制造假冒偽劣葡萄酒產品，擾亂葡萄酒市場，危害消費者健康[6-7]。近年來，國家有關部門在對全國葡萄酒的抽檢過程中發現，濫用添加劑現象時有發生，因此葡萄酒中違規使用的添加劑也成為國家食品安全監督抽檢的重點項目。隨著我國食品安全監管水平的提升，為提高工作效率，方便監管部門和生產企業對葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素的日常監測，開發靈敏度高、適用性廣的高通量檢測方法以有效地應對添加劑在葡萄酒中的濫用，以及應對突發食品安全事件具有重要的現實意義[8]。

為保障食品安全，需要對葡萄酒中食品添加劑的含量進行檢測。目前，國標[9-11]有針對葡萄酒中防腐劑、色素和甜味劑等的檢測方法，但這些標準大都針對單一或某幾種食品添加劑，且樣品的預處理方法各不相同，對于葡萄酒中多種添加劑則需要逐一測定，程序繁雜，檢測時間長，效率很低[6，12]，在進行批量樣品檢測時，需要大量的人力物力。近年來，國內外關于葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素檢測方法的文獻報道很多，主要采用離子色譜法[13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜[15-16]、高效液相色譜-質譜法[17-18]等，雖然相關檢測方法的報道很多，在檢測靈敏度和準確度方面均有所提高，但經文獻檢索，大多只針對某一類添加劑進行檢測，不利于對葡萄酒中多類添加劑的大規模篩查。另外，包括我國國家標準在內，目前最為普遍的分析方法為液相色譜法[19-20]，該方法不能提供目標化合物的化學結構信息，抗干擾能力相對較弱，在實際樣品分析時容易受到基質干擾而產生假陽性現象[5，21]。液相色譜與質譜聯用技術能夠在一定程度上降低基質干擾，對于需要高靈敏度、寬適用范圍的檢測工作而言，已成為最佳的手段之一，逐漸應用于添加劑的檢測[22]。本實驗采用高效液相色譜-串聯質譜技術，利用高效液相色譜的強分離能力和質譜準確定性、高選擇性和高靈敏度的特點，在較短的時間內即可完成多組分的分離鑒定，建立了一種可同時測定并能夠準確定性定量葡萄酒中防腐劑、甜味劑和色素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄酒樣：購自零售超市和商店。

儀器設備：LCMS-8050高效液相色譜-串聯質譜儀（日本Shimadzu公司，具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵，DGU-20A3R在線脫氣機，SIL-20AXR自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統控制器，LCMS-8050三重四極桿質譜儀，Lab-Solutions Ver.5.91色譜工作站）；Milli-Q Reference超純水器（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm，美國Waters公司）；0.22 μm尼龍濾膜（上海安譜科學儀器有限公司）。

試劑：甲醇、乙腈、乙酸、乙酸銨（HPLC級，Dikma公司）；甜蜜素（Sodium cycamate）、安賽蜜（Acesulfame-K）、糖精鈉（Saccharin sodium）、阿斯巴甜（Aspartame）、三氯蔗糖（Sucralose）、甜菊糖苷（Stevioside）、紐甜（Neotame）、阿力甜（Alitame）；誘惑紅（Allura red）、赤蘚紅（Erythrosine）、莧菜紅（Amaranth）、胭脂紅（Carmine）、檸檬黃（Tartrazine）、日落黃（Sunset yellow）、亮藍（Brilliant blue）；脫氫乙酸（Dehydroacetic acid），美國Sigma-Aldrich公司，加拿大TRC公司和德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥95%。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別準確稱取16種添加劑標準品于10 mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為1 mg/mL的單標儲備液，于-18℃下避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標準工作液，于4℃避光保存。根據需要用流動相逐級稀釋，配制成適當濃度的混合標準工作液，現配現用。

1.2.2 樣品前處理方法

取葡萄酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm，美國Waters公司）。流動相：（A）甲醇和（B）10 mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35 mL/min；梯度洗脫程序為：0 min，甲醇的體積分數為10%；0～3 min，甲醇的體積分數從10%升至90%，并保持2.5 min，5.5～5.51 min；甲醇的體積分數從90%降至10%；5.51 min～6.5 min，甲醇的體積分數保持10%。柱溫為35℃；進樣體積：2 μL。

1.2.4 質譜條件

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正負離子同時掃描；離子源接口電壓：0.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應監測(MRM)；駐留時間：15 ms；延遲時間：3 ms；16種添加劑標準品MRM參數見表1。

表1 16種添加劑的保留時間和質譜條件

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

與其他分析手段不同，質譜分析往往存在一定的基質效應，當使用ESI源時，在離子化過程中基質組分與目標物競爭，更易出現基質抑制效應。減少基質效應的方法通常有稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、配制基質匹配標準溶液等[23]。本研究采用直接進樣方式進行分析，以避免傳統的液液萃取、固相萃取方法回收率低、重復性差，且會使用大量溶劑的弊端，但考慮到葡萄酒中含有一定比例乙醇和糖類，為減少基質效應對測定的影響，需對樣品進行稀釋處理。稀釋的方法可以降低乙醇對色譜峰形影響，減弱基質效應，但是會降低方法的檢出限。經過對主流品牌的葡萄酒分別稀釋2～15倍進行檢測，不同稀釋倍數樣品測試對比，最終確定稀釋倍數為5倍。

2.2 色譜和質譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇

反相色譜的流動相通常由水和有機溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，由于某些被測物極性較強，流動相的洗脫能力不宜過強，同時待分離的16種添加劑有些極性相近，保留時間相近，采用乙腈為有機相時導致幾個組分“共流出”情況較甲醇嚴重，而甲醇可使16種添加劑的保留時間相對延遲，同時甲醇可以提高離子化程度，峰面積比用乙腈為流動相時大，故選擇甲醇為實驗的有機相；又由于流動相要進入質譜儀，添加一定量的緩沖溶液可以增加響應值，所以考慮甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動相體系。以被測物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標對3種流動相體系進行了比較。結果表明，體系中添加了乙酸銨不僅更有利于分離物質在色譜柱上的保留，而且能夠提高色素類物質的電離化程度，增加信號響應，從各物質分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩定性等指標進行綜合衡量，甲醇-10 mmol/L乙酸銨作為流動相時，優于其余兩種流動相，故實驗選用甲醇-10 mmol/L乙酸銨為流動相進行梯度洗脫。

2.2.2 柱溫的選擇

柱溫能夠影響色譜柱的柱效、選擇性、靈敏度和穩定性，柱溫的改變直接影響分離效果及分離速率。升高柱溫，色譜柱內離子交換速率隨之升高，有利于提高柱效、縮短分析時間[24]。本實驗考察了柱溫分別為30℃、35℃、40℃時，16種添加劑保留時間及響應值的差別，發現當柱溫為30℃時，16種添加劑有13種出峰時間均集中在3～4 min，分離度差；提高柱溫至35℃時，柱效提高，分離度和靈敏度均有改善，繼續提高柱溫，分離情況無明顯變化?？紤]到色譜柱在相對較低溫度下使用壽命較長，本實驗設定柱溫為35℃。優化條件下16種添加劑的MRM質譜圖見圖1。

2.2.3 質譜條件的選擇

為獲得最佳的靈敏度和分離效果，根據16種添加劑的分子結構特征，在正、負兩種電離模式下優化被測物的母離子和特征子離子以及相應的質譜參數。取質量濃度為1 mg/L的16種化合物單標準溶液依次采用不接色譜柱直接進樣方式進行質譜全掃描檢測，得到目標分析物一級質譜圖，再用氬氣轟擊該母離子，得到其二級質譜圖，利用儀器的自動優化功能，分別對Q1、Q3、CE等進行優化，確定16種添加劑的母離子和子離子的最佳質譜條件，以強度較大的子離子作為定量離子，強度稍小的子離子為定性離子，各化合物的定量離子及定性離子見表1。在優化的色譜和質譜條件下16種被測物的總離子流（TIC）圖見圖1。

圖1 16種添加劑混合標準溶液的總離子流圖

2.3 方法學評價

2.3.1 方法的線性范圍和檢出限

將含16種被測物的混合標準儲備液添加至稀釋5倍的空白葡萄酒樣品中，分別配制系列混合標準工作液，按1.2部分所確定的色譜和質譜條件進行檢測，以各組分定量離子色譜峰面積對相應的質量濃度繪制各被測物的標準工作曲線，結果表明，線性關系良好，相關系數（r2）都在0.995以上。

表2 16種被測物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

用葡萄酒樣品低加標水平計算各組分的檢出限和定量限，用信噪比為3確定方法的檢出限（LOD），用信噪比為10確定方法的定量限（LOQ），各組分在葡萄酒樣品中的檢出限范圍在0.2～2 μg/L之間。結果見表2。

2.3.2 精密度和回收率

用微量移液器向空白葡萄酒樣品中準確加入一定量的16種待測物混合標準溶液，配成低、中、高3個濃度水平進行回收率實驗，按1.2節所述實驗步驟進行處理和測定，進行6次重復實驗，計算其回收率及相對標準偏差（RSD）。結果表明，各目標物平均回收率在89.1%～106.4%之間，相對標準偏差小于9.7%，方法的準確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

2.4 實際樣品的測定

按所建立的方法對采購的10批次葡萄酒樣品進行了16種添加劑的篩查，每個樣品重復測定3次。所檢葡萄酒樣品中有1個檢出糖精鈉和甜蜜素，含量分別為26.3 μg/L、38.9 μg/L，其余樣品的檢測結果均為陰性。陽性樣品的MRM質譜圖見圖2。

圖2 某葡萄酒樣品中檢出的糖精鈉和甜蜜素質譜圖

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜儀同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素含量的方法，前處理簡單、分析速度快、準確度和靈敏度高。實際樣品的檢測表明，該方法能夠滿足葡萄酒甜味劑、防腐劑和色素殘留的分析要求，與國標方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本，能夠滿足葡萄酒中痕量分析要求，非常適合大批量葡萄酒樣品中16種添加劑的定性和定量分析。