芽孢桿菌在中國白酒釀造中的應(yīng)用機理研究進展

羅 莉，李 欣，常 煦，李兆飛，賈 盼，李志軍

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，湖北宜昌443003； 2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北武漢430068； 3.安琪酵母股份有限公司釀造與生物能源事業(yè)部，釀造與生物能源研究所，湖北宜昌443003）

芽孢桿菌是環(huán)境中存在非常廣泛的一類微生物，在現(xiàn)代生物技術(shù)的幫助下，芽孢桿菌已經(jīng)廣泛應(yīng)用于諸如飼料、生物農(nóng)藥等重要領(lǐng)域[1-3]。在白酒釀造領(lǐng)域，隨著對釀造中微生物的不斷探索和發(fā)酵機理的研究，越來越多的數(shù)據(jù)和報告顯示，芽孢桿菌在白酒釀造中也占有非常重要的地位，多菌種共發(fā)酵是白酒發(fā)酵區(qū)別于絕大多數(shù)酒種發(fā)酵的主要特征之一，而芽孢桿菌在中國主流大曲白酒發(fā)酵中確實起著非常重要的作用[4-8]。

中國傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵是以自然微生物環(huán)境為基礎(chǔ)，以水分、溫度等宏觀參數(shù)調(diào)控為主的發(fā)酵方式，因此該發(fā)酵過程受環(huán)境因素影響很大，而且難以控制。現(xiàn)代釀造學(xué)的核心是微生物，通過對微生物生理生化過程的了解，可以從微觀上精確的對釀造過程進行調(diào)控，從而達到釀造工藝升級的目的[9]。本文就芽孢桿菌目前在白酒釀造中的整個研究及應(yīng)用情況做一個綜述性匯總，同時闡述該類微生物工業(yè)應(yīng)用的可行性及應(yīng)用方向，供白酒企業(yè)研發(fā)及相關(guān)生產(chǎn)人員參考。

1 芽孢桿菌在不同香型白酒的研究進展

“曲”在中國白酒釀造中占有極重要的地位，所謂“曲為酒之骨”，可以說“曲”決定了中國白酒釀造的風(fēng)格特點。曲從實質(zhì)上說，是一個微生物以及酶系的復(fù)雜組合系統(tǒng)，制曲的過程實際上就是一個微生物篩選、擴大培養(yǎng)以及所產(chǎn)酶系富集的過程[10]。很多學(xué)者利用“曲”這一本質(zhì)特點，開始對曲中的有益微生物加以區(qū)分和研究，芽孢桿菌就是其中一類微生物。

1.1 芽孢桿菌在醬香型白酒中的研究進展

從目前國內(nèi)白酒領(lǐng)域?qū)ρ挎邨U菌的研究可以看出，最主要的還是集中在醬香型白酒大曲中，現(xiàn)有的研究報告中，超過80%的研究都與醬香型白酒大曲相關(guān)，足以說明芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)中的重要地位。醬香型大曲是典型的高溫曲，在制曲過程中，品溫會高達60℃以上，在這個溫度條件下，絕大多數(shù)霉菌、酵母菌難以存活，而在這種條件下，一些具備耐溫性能的芽孢桿菌以及曲霉就被自然篩選了出來，作為醬香型大曲的基礎(chǔ)菌[11]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，在醬香型酒曲中，芽孢桿菌的數(shù)量占有絕對地位。楊代永等對茅臺酒曲中的微生物進行分析后發(fā)現(xiàn)，在成熟酒曲中，芽孢桿菌的微生物數(shù)量占比近80%，其他為曲霉和極少量的酵母[12]。在楊帆等的后續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)在茅臺酒極易分離的芽孢桿菌中，有3種芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌MTDB-01、地衣芽孢桿菌MTDB-02和枯草芽孢桿菌MTDB-03分別占了細菌總數(shù)的28%、37%和23%，說明在茅臺酒發(fā)酵過程已經(jīng)形成了比較固定的芽孢桿菌發(fā)酵系統(tǒng)比例。對這3株芽孢桿菌進行了發(fā)酵性能分析，結(jié)果顯示，通過芽孢桿菌發(fā)酵后生成了乙偶姻、三甲基吡嗪等10余種風(fēng)味成分，通過與大曲主要揮發(fā)成分進行比較后，確認這3株芽孢桿菌為大曲風(fēng)味物質(zhì)形成的主要功能菌[13]。

研究認為，芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)過程中，對于醬香型風(fēng)味的生成有著至關(guān)重要的作用。張榮對醬香型大曲發(fā)酵液進行風(fēng)味分析后，將乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾作為特征風(fēng)味物質(zhì)。然后對1株從醬香型大曲中分離到的地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifoumis）進行了風(fēng)味發(fā)酵分析后發(fā)現(xiàn)，該芽孢桿菌可以通過發(fā)酵直接生成乙偶姻，而且更加明確的是，在55℃高溫環(huán)境下，芽孢桿菌3-羥基丁酮的生成量明顯要高于37℃、45℃，進一步說明了高溫堆積對該類物質(zhì)生成的促進作用[14]。

1.2 芽孢桿菌在其他香型白酒中的研究進展

中國學(xué)者幾乎從所有的酒種酒曲中都分離到了芽孢桿菌。王海燕等對清香型小曲中的微生物組成及功能進行了詳盡的分析，其中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌類是普遍存在的細菌類微生物[15]。此外，該學(xué)者還對不同工藝大曲中的微生物進行了系統(tǒng)的分析，研究發(fā)現(xiàn)，溫度是影響大曲中細菌組成的重要因素。數(shù)據(jù)顯示，在濃香型大曲與芝麻香型大曲比較中，芽孢桿菌的數(shù)量占到了芝麻香型大曲微生物總體的33.64%，而濃香型大曲中只占2.4%[16]。葉光斌對清香型大曲細菌菌落結(jié)構(gòu)進行了分析比較后發(fā)現(xiàn)，在3種清香大曲（清茬曲、后火曲、紅心曲）中，后火曲和紅心曲細菌中，芽孢桿菌所占的比例要明顯高于清茬曲，這個也從側(cè)面說明了在制曲過程中，溫度是對芽孢桿菌篩選和擴配的核心因素之一[17]。上述報告結(jié)果說明，在小曲清香、大曲清香以及濃香型大曲中都可以檢測到芽孢桿菌的存在，而另外一些學(xué)者已經(jīng)將芽孢桿菌對非醬香型白酒的影響做了一些研究和分析。

表1 芽孢桿菌產(chǎn)酶特性研究進展

曹振華等在瀘型（濃香型）大曲中考察了大曲中的芽孢桿菌數(shù)量、霉菌數(shù)量以及酵母菌的數(shù)量和酒曲等級優(yōu)劣的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，曲香＞10的優(yōu)質(zhì)大曲，這3類微生物的數(shù)量均高于曲香≤10的大曲，尤其是芽孢桿菌的數(shù)量前者是后者的13.5倍，由此可以確定芽孢桿菌對瀘型大曲質(zhì)量有重要作用。同時，不同等級的瀘型大曲在酯化力、發(fā)酵力方面的差異不大，在此基礎(chǔ)上通過曲香對曲質(zhì)的等級進行劃分，從側(cè)面上也說明了芽孢桿菌對于濃香型大曲的重要作用[18]。曾婷婷等通過應(yīng)用芽孢桿菌菌液參與特香型酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在芽孢桿菌的輔助下，可以有效提高酒基中總酸、總酯和主要風(fēng)味物質(zhì)的含量，而對于多元醇的生成芽孢桿菌無明顯影響[19]。楊春霞等從牛欄山地缸酒醅中篩選出5株芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），通過對這些芽孢桿菌發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定后發(fā)現(xiàn)，不同的芽孢桿菌發(fā)酵對風(fēng)味貢獻差異較大，其中地衣芽孢桿菌產(chǎn)生較多的酯類和含氮化合物，蠟狀芽孢桿菌與酯類和醛酮類化合物的合成更為緊密，短小芽孢桿菌有更多的烴類和醇類物質(zhì)生成，而枯草芽孢桿菌的生成物中主要為雜環(huán)類化合物；報告同時指出，雖然不同芽孢桿菌的生成物有較大差別，但所有的芽孢桿菌都有一種共有產(chǎn)物乙偶姻[20]。

黨的十八大以來，習(xí)近平總書記提出了以科技創(chuàng)新為核心的全面創(chuàng)新，而科研院所在地方科技創(chuàng)新體系中具有舉足輕重的作用，是技術(shù)創(chuàng)新的重要載體。地方科研院所所具備的原始研發(fā)能力，特別是關(guān)鍵共性技術(shù)研發(fā)能力、政產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新能力和精準對接區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展的能力，這些是高校和企業(yè)所不具備的。在歷次深化改革過程中，地方科研院所不斷調(diào)整自身，尋得了各具特色的生存方式。當(dāng)前政府主管部門正著手探索推動地方科研院所與高等院校融合這一新趨勢，為科研院所解決了困擾多年的體制機制束縛問題，為實現(xiàn)長期穩(wěn)定發(fā)展提供了良好的機遇，但同時也伴隨著嚴峻的挑戰(zhàn)。

2 芽孢桿菌作用機理研究進展

作為已經(jīng)明確的重要釀造微生物，需要對芽孢桿菌在白酒釀造中的作用機理進行研究。一方面，了解芽孢桿菌的作用機理可以為發(fā)酵調(diào)控提供理論及數(shù)據(jù)支撐。另外，還可以根據(jù)已知作用機理對芽孢桿菌進行商品化以及應(yīng)用技術(shù)做出指導(dǎo)。

2.1 芽孢桿菌酶系研究進展

芽孢桿菌具有很強的酶產(chǎn)生能力，其中研究比較多的諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等具有較強的產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力。此外，一些芽孢桿菌還具有降解木聚糖、果膠、地衣聚糖等物質(zhì)的能力[21]。目前對于芽孢桿菌酶系研究比較廣泛的主要分布在飼料領(lǐng)域，而對于白酒領(lǐng)域芽孢桿菌的產(chǎn)酶及相關(guān)特性研究還處在比較初級的階段，但不可否認的是，芽孢桿菌所產(chǎn)酶在白酒釀造領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。近年來對芽孢桿菌產(chǎn)酶特性的研究進展見表1。

如表1所示，芽孢桿菌在蛋白酶、淀粉酶以及纖維素酶方面都具有一定的優(yōu)勢。從固態(tài)白酒發(fā)酵特點看，這些酶類的生成和富集可以有效降解原料中的蛋白、淀粉以及纖維素類物質(zhì)，這樣可以提高原料利用率、為微生物發(fā)酵提供必要的營養(yǎng)元素以及為一些風(fēng)味物質(zhì)提供必要的前體。但芽孢桿菌的生物酶系在白酒釀造中的作用過程還需要進一步進行研究和探索。

2.2 芽孢桿菌風(fēng)味物質(zhì)合成機理研究進展

在前面的論述中，可以明確的是芽孢桿菌是中國白酒釀造中的一類重要微生物。中國白酒是注重風(fēng)味的發(fā)酵食品，而產(chǎn)生這些特征風(fēng)味的核心因素還是微生物的作用，而芽孢桿菌在白酒釀造中對白酒風(fēng)味的影響自然成為學(xué)者研究的重點[26-27]。近年來對于芽孢桿菌和風(fēng)味成分的關(guān)系機理的研究，大體上可分為兩方面的研究，芽孢桿菌的直接發(fā)酵風(fēng)味和間接發(fā)酵風(fēng)味的研究。

2.2.1 芽孢桿菌直接發(fā)酵風(fēng)味研究

芽孢桿菌在生長發(fā)酵過程中，一方面產(chǎn)生豐富的酶系對原料加以分解，另外通過復(fù)雜的生理生化過程，合成豐富的風(fēng)味物質(zhì)。黃永光等對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌以高粱、小麥為培養(yǎng)基對這3種芽孢桿菌的生成物進行詳盡分析，結(jié)果顯示，不同芽孢桿菌在培養(yǎng)后均可以直接形成非常復(fù)雜的風(fēng)味，雖然最終風(fēng)味各有特色，但在一些特征產(chǎn)物諸如3-甲基丁醇、2,3-二丁醇、3-羥基-2-丁酮以及吡嗪類等都有非常相似的代謝產(chǎn)物組分；該作者對風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生代謝途徑進行非常詳細的分析，結(jié)果見表2[28]。

表2 醬香型白酒中主要產(chǎn)香風(fēng)味的3類芽孢桿菌的主要風(fēng)味成分代謝途徑

在芽孢桿菌風(fēng)味代謝產(chǎn)物機理研究過程中，無論是醬香型、濃香型還是清香型大曲中所分離的芽孢桿菌，都有一個相同的代謝產(chǎn)物3-羥基-2-丁醇。該產(chǎn)物是芽孢桿菌直接生物代謝所得，該物質(zhì)是重要的呈香物質(zhì)，同時對芽孢桿菌發(fā)酵性能優(yōu)劣具有指向作用。

白酒風(fēng)味是一個非常復(fù)雜的體系，芽孢桿菌除了通過自身發(fā)酵所得到的直接風(fēng)味物質(zhì)外，還可以產(chǎn)生一些風(fēng)味合成前體物質(zhì)，通過一些化學(xué)或者生物作用來進一步合成復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)。

2.2.2 與芽孢桿菌相關(guān)的間接風(fēng)味物質(zhì)生成機理

在間接風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生研究中，目前主要分為兩個主要的方面，一個是研究比較早的美拉德反應(yīng)，另外一個是現(xiàn)在逐漸興起的微生物協(xié)同發(fā)酵研究。

早在20世紀90年代初，劉曉光等[29]就對芽孢桿菌參與下的美拉德反應(yīng)和醬香風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生進行了實驗和論述，初步確認了通過芽孢桿菌對原料的分解，一些氨基酸得到了積累，而后通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜醬香的這一過程。在之后的20多年間，包括謝和、莊名揚等都在美拉德反應(yīng)與醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生方面做了更深入的研究[29-30]。四甲基吡嗪是醬香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，吳建峰針對該物質(zhì)進行針對性的探索后明確發(fā)現(xiàn)，四甲基吡嗪的合成需要兩個階段：第一階段是在中低溫條件下，通過細菌產(chǎn)生3-羥基丁酮和氨；而第二階段屬于標準的美拉德反應(yīng)，通過在高溫條件下，3-羥基丁酮和氨進行縮合反應(yīng)，最終形成四甲基吡嗪。在這個研究中，通過菌種及發(fā)酵模型建立，與傳統(tǒng)方法發(fā)酵相比，曲中的四甲基吡嗪含量提高了4倍，最終酒體中四甲基吡嗪的含量提高了7.5倍[31]，該研究結(jié)果非常清晰地說明了四甲基吡嗪的合成途徑，其中該物質(zhì)的重要合成前體3-羥基丁酮是芽孢桿菌非常重要的發(fā)酵產(chǎn)物。事實上，關(guān)于芽孢桿菌與美拉德反應(yīng)和白酒風(fēng)味的研究并不多，目前主要集中在醬香型白酒領(lǐng)域，相關(guān)機理研究已經(jīng)可以支撐和明確，為微生物工業(yè)應(yīng)用進行指導(dǎo)和問題解決。

除了上述的美拉德反應(yīng)以外，以芽孢桿菌代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)，通過多種微生物協(xié)同也開始進行初步的探索。中國白酒是一個復(fù)雜微生物發(fā)酵體系，其中所發(fā)生的各種生物反應(yīng)及化學(xué)反應(yīng)不計其數(shù)，探索微生物間的協(xié)同作用可以更好的解析白酒發(fā)酵過程。孟醒、徐巖等[32]研究了釀酒酵母與地衣芽孢桿菌的相互作用，并從蛋白組學(xué)的角度對其作用機制進行了分析，研究結(jié)果顯示，釀酒酵母與芽孢桿菌協(xié)同生長下，酵母對芽孢桿菌的拮抗作用比較明顯，雖然釀酒酵母本身生長沒有受到影響，但是其代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著的變化，在協(xié)同發(fā)酵狀態(tài)下，酵母所產(chǎn)生的乙醇及有機酸中的丙酮酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸以及酒石酸的產(chǎn)量分別高出純培養(yǎng)的11.8%、56.8%、36.3%、24.3%、48.2%及27.7%，至于出現(xiàn)這個現(xiàn)象的原因，該學(xué)者從蛋白組學(xué)上進行了解析，通過地衣芽孢桿菌的誘導(dǎo)作用，釀酒酵母內(nèi)的69個蛋白差異表達出現(xiàn)了高達2倍的差異，這是生物代謝產(chǎn)生明顯差異的原因。

通過眾多科研人員的研究，可以明確在中國固態(tài)白酒釀造過程中，芽孢桿菌是一類非常重要的微生物，其生物作用直接影響到白酒核心風(fēng)格的形成，所以對于該類微生物的作用機理以及與其他微生物的協(xié)同作用將會是后續(xù)關(guān)注的重點。

3 前景和展望

依靠環(huán)境微生物進行發(fā)酵的中國白酒，尤其是大曲固態(tài)白酒發(fā)酵帶來了獨一無二的風(fēng)味風(fēng)格和地域特色。但換句話來說，這種發(fā)酵方式也在一定程度上阻礙了行業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展路線。以中國勁酒為例，其在近些年通過結(jié)合現(xiàn)代化設(shè)備改造，配合先進的自動化控制技術(shù)，對白酒釀造工藝進行了大膽的創(chuàng)新，實現(xiàn)了生產(chǎn)效率成倍提高、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定提升、生產(chǎn)降耗明顯，并顯著提升了企業(yè)的管理水平，更為重要的是，這種改變將使白酒風(fēng)格穩(wěn)定，異地生產(chǎn)成為可能，這種改變成為未來中國白酒發(fā)展的方向之一[33]。

芽孢桿菌目前已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用，在飼料、環(huán)保領(lǐng)域，對芽孢桿菌的應(yīng)用已經(jīng)成為普遍的共識并已形成業(yè)內(nèi)通用的應(yīng)用方式和工藝。而在白酒釀造領(lǐng)域，越來越多的學(xué)者經(jīng)過不斷的努力探索，已經(jīng)明確芽孢桿菌至少在中國某一大類白酒釀造中具有重要的地位和作用，因此進一步探索芽孢桿菌在中國白酒生產(chǎn)中的實際應(yīng)用方式以及工藝控制條件是目前需要更多加以關(guān)注的方面，而且通過這些研究，有望推動中國白酒生產(chǎn)的機械化升級以及控制工藝升級，推進中國白酒的現(xiàn)代化工藝升級。