高通量測序技術在洋河大曲質量等級判定中的應用

蘇 葛，王曉慧，董大偉，馬 偉，楊建梅，葉 紅

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

俗話說：“曲定酒型”，在曲與酒的關系上，曲占先導地位。曲即為曲類微生物的載體，曲類微生物作用于糖類或淀粉類物質而生成酒[1]。獨具綿柔特色的洋河酒自明代中后期開始出現大曲制作技藝，并逐漸形成“先制曲、后釀酒”的具有地方特色、較先進的生產模式。從此釀酒離不開制曲，曲為酒骨，大曲質量直接或間接影響著最終酒的產質量。

大曲是重要的菌源，大曲微生物作為釀造環境中的分解者、消費者、初級生產者和次級生產者，在整個釀造鏈中起重要作用。洋河酒廠對傳統制曲的質量判定最早依賴于熟練的制曲工人對于大曲外觀、香味、斷面、色澤等感官層面的生產經驗。20世紀80年代以后，增加了糖化力、酯化力、發酵力等理化指標共同判定。而現階段，隨著高通量測序技術在各個領域中對微生物群落研究的突破和發展，利用先進技術破解和揭示傳統釀酒行業的微觀密碼已是趨勢所向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大曲樣品：洋河自制中高溫大曲。

1.2 實驗儀器

Miseq PE300平臺、美國ABI GeneAmp?9700型PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA抽提

待基因組DNA抽提完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提和收集的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增

按指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物。隨機抽取樣本進行預實驗，以確保在較低循環數中能夠將絕大多數樣本擴增出適宜濃度的產物。PCR 采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個樣本3個平行樣，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測混合后的PCR產物，使用AxyPrep-DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 熒光定量

根據電泳的定量結果，使用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統對PCR產物進行檢測定量，根據樣本的測序量要求進行相應比例的混合。

1.3.4 Miseq文庫構建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.5 Miseq測序

(1)DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上。

(2)另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋 (bridge)”。

(3)PCR擴增，產生DNA簇。

(4)DNA擴增子線性化成為單鏈。

(5)加入經改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成一個堿基。

(6)用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。

(7)將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端黏性，繼續聚合第二個核苷酸。

(8)統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

2 結果與分析

2.1 春季不同感官等級大曲群落結構分析

我們選取春季制作后儲存6個月的貯存曲，邀請大曲感官評價經驗豐富的工作人員在庫房中用傳統經驗判定法挑選感官等級為優等、一等和二等的貯存曲，編號后分別粉碎過40目篩，-80℃冰箱保存。按照1.3的實驗方法進行高通量測序分析，其群落結構分析結果詳見圖1、圖2，各群落結構豐度占比詳見表1、表2，其中1號為優等曲、2號為一等曲、3號為二等曲。

2.2 夏季不同感官等級大曲群落結構分析

圖1 春季曲群落結構組成圖（細菌）

圖2 春季曲群落結構組成圖（真菌）

為了進一步探究春季和冬季優級大曲中的優勢菌群是否相同，我們又選取夏季制作后儲存6個月的貯存曲，邀請大曲感官評價經驗豐富的工作人員在庫房中用傳統經驗判定法挑選感官等級為優等、一等和二等的貯存曲，編號后分別粉碎過40目篩，-80℃冰箱保存。按照1.3的實驗方法進行高通量測序分析，其群落結構分析結果詳見圖3、圖4，各群落結構豐度占比詳見表3、表4，其中1號為優等曲、2號為一等曲、3號為二等曲。

圖3 夏季曲群落結構組成圖（細菌）

表1 春季曲群落相對豐度占比圖（細菌）

表2 春季曲群落相對豐度占比圖（真菌）

圖4 夏季曲群落結構組成圖-真菌

2.3 功能性分析

2.3.1 主體優勢菌發酵功能分析

2.3.1.1Kroppenstedtia菌屬

Kroppenstedtia屬于高溫放線菌科[2]，釀造中具體作用未知，且目前行業研究較少。在釀酒過程中，我們推測Kroppenstedtia菌屬發酵功能類似高溫放線菌科多數菌屬，可參與土壤中有機物的轉化，產生多種酶類物質。

2.3.1.2 魏斯氏菌

魏斯氏菌屬于乳酸菌，是一種選擇性厭氧菌，在微氧條件下生長迅速。在釀造過程中，可以發酵葡萄糖產生乳酸，或者發酵葡萄糖產生二氧化碳、乙醇或乙酸。其次魏斯氏菌能表達β-葡萄糖苷酶，并推測其在發酵中可降解纖維素[3]。

2.3.1.3 乳酸桿菌/乳酸片球菌

乳酸桿菌/乳酸片球菌屬于乳酸菌，是固態白酒生產的重要微生物，在發酵過程中，具有促進美拉德反應、促進酒醅的發酵、維持釀酒微生態環境等作用[4]。

2.3.1.4 芽孢桿菌

芽孢桿菌能產生纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶及葡萄糖異構酶等，在芽孢桿菌屬中也有不少能產乳酸的細菌。其中枯草芽孢桿菌是生成酒體的芳香類物質如雙乙酰的菌源，是不可缺少的細菌。

表3 夏季曲群落相對豐度占比圖（細菌）

表4 夏季曲群落相對豐度占比圖（真菌）

2.3.1.5 高溫放線菌

高溫放線菌被微生物學界認為是一類能夠在極端環境下生長代謝的革蘭氏陽性、化能異氧菌，該菌屬下的大多細菌能在較高的溫度（50℃以上）環境下生長[5]。放線菌不僅參與土壤中有機物質的轉化活動，而且產生許多酶類物質，例如纖維素酶、蛋白酶、纖維蛋白溶酶、淀粉酶等，定向功能包括：降解淀粉、纖維素、將蛋白質水解為多肽、為己酸菌生產繁殖和底物代謝提供前體物質等[6]。

2.3.2 等級曲微生物功能對比分析

2.3.2.1 春季曲等級對比分析

春季曲1#、2#、3#對比發現，3類曲的優勢菌種以及相對豐度占比全然不同，其中優等曲的優勢菌種相對豐富，Kroppenstedtia克羅彭斯特菌屬（屬于一種高溫放線菌）占比55%；魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬同屬于乳桿菌科，共占比22%；這3類細菌在釀酒中都屬于有益菌，一等曲芽孢桿菌屬占比最高為74%，克羅彭斯特菌屬占比19%，芽孢桿菌也在釀酒中起著重要的作用。二等曲葡萄球菌占比77%（多數葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產酸不產氣），二等曲發酵作用較一類、二類曲弱。

2.3.2.2 夏季曲等級對比分析

夏季曲1#、2#、3#對比發現，3類曲的優勢菌種以及相對豐度占比全然不同，優等曲有益菌占比最高達93%，其中高溫放線菌占比達78%，優勢菌種明顯，也反映出一類曲不僅糖化發酵作用強，同時也具備較優的生香功能；一等曲高溫放線菌占比33%，相對發酵功能弱于優等曲。二等曲優勢菌種不明顯，其中乳酸菌類偏多，且雜菌種類較多。從此可以看出，斷面表象較差的大曲，功能性不穩定，雜菌偏多。

綜上所述，通過高通量測序技術能夠更為清晰、直觀地剖析不同質量等級中高溫大曲，并通過不同季節大曲群落結構比對可得出以下結論：（1）優等曲有益細菌群落結構優于一等曲和二等曲；二等曲雖然有一定比例的有益菌，但其優勢菌種不明顯，雜菌較多，所以從微觀細菌群落結構分析，就細菌發酵功能而言，優等曲＞一等曲＞二等曲，證明了傳統感官判定經驗的科學性與一致性；（2）通過春、夏兩季曲的細菌群落結構比對發現，以優等曲為例，春季優等曲優勢菌種為克羅彭斯特菌屬，而夏季為高溫放線菌，因此，我們認為，大曲主要菌種構成與季節息息相關；（3）利用二代測序研究真菌群落結構暫未發現重大突破，待進一步分析與研究。

3 結論

傳統中高溫大曲質量等級判定使用感官經驗判定法，該方法雖簡單、高效，但簡單的感官和理化指標并不能從微觀層面鑒定大曲質量差異。本研究針對不同季節（春季、夏季）產出的不同等級（優等曲、一等曲、二等曲）中高溫大曲進行取樣測定，剖析不同質量等級大曲的微生物群落多樣性。該研究顯示，中高溫大曲感官等級與微生物優勢細菌群落組成之間具有一致性，且大曲主要菌種構成與季節息息相關，利用高通量測序技術能夠科學鑒定中高溫大曲質量等級。本研究對指導大曲生產及大曲科學評價體系的構建具有重要意義。