環孢素A對大鼠急性脊髓損傷后炎癥反應的影響

吳賢良, 黃建軍, 楊智明, 許衛紅

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是臨床常見的一類中樞神經系統創傷。SCI根據其病理生理機制的不同而分為原發性損傷及繼發性損傷，繼發性損傷是在原發性損傷的基礎上伴發的多種生化級聯反應。神經炎癥作為繼發性損傷的主要機制之一，會加重繼發性SCI，部分研究已通過靶向干預，證實了抑制機體免疫可減輕炎癥對繼發性損傷的影響[1-2]。文獻報道，SCI后，清除或抑制中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞，或者抑制白細胞介素(interleukin，IL)-1β，IL-6等促炎因子均能促進脊髓神經功能恢復[3-4]。因此，抑制SCI后的炎癥反應可以減少神經組織的進一步損傷并為神經修復提供適宜的環境。環孢素A(cyclosporin A，CsA)是選擇性抑制T淋巴細胞的免疫抑制劑，主要是通過抑制輔助性T細胞增殖而發揮作用。正常脊髓組織中僅有極少數T淋巴細胞存在，而SCI后，T淋巴細胞數量急劇上升[5-6]，并浸潤中樞神經系統組織導致促炎細胞因子大量釋放[7-8]。因此，CsA選擇性抑制T淋巴細胞增殖可顯著減輕促炎因子的釋放而在神經系統中發揮抗炎作用，進而減輕繼發性SCI。既往SCI的熱點研究主要集中在軸突的再生及干細胞的移植等方面[9]。本研究將大鼠SCI后的行為學評估和損傷脊髓的組織學評估相結合，通過CsA的干預控制神經炎癥反應，探討CsA在大鼠繼發性SCI中可能的作用機制，為CsA用于臨床SCI的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1動物 健康成年雄性SD大鼠75 只，體質量220～260 g[福建醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(滬)2007-0005]，單籠飼養，飼養環境溫度控制于20～23 ℃，濕度50%～60%，自由晝夜光線照明，動物自由進食，進水。

1.2動物模型制備 大鼠于術前禁食8 h，紫外線消毒手術臺及相關物品30 min，手術器械經蒸汽高壓消毒。10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，針刺下肢確認麻醉成功后剔除背部毛發，將動物俯臥位固定于手術臺。定位T10手術節段后，常規消毒。以T10為中心，行長約3 cm背部正中切口，依次切開皮膚、皮下，分離兩側椎旁肌肉，顯露T9～T11節段棘突及椎板，小型拉鉤撐開。組織鉗輕輕提起T10棘突，顯露T10與T11間椎間隙，小型椎板咬骨鉗咬除T11棘突及T10椎板，顯露T10節段脊髓。用一打擊面直徑為3 mm的圓形薄墊片覆蓋于T10脊髓表面，以重10 g的鐵棒經垂直圓柱套筒自25 mm高度自由墜落打擊該墊片，造成T10節段脊髓挫傷。建模成功后，予生理鹽水沖洗傷口，3-0絲線逐層縫合切口，待麻醉蘇醒后單籠飼養。

1.3動物分組 75 只大鼠隨機分為3 組，假手術組(sham組，n=25)：僅摘除椎板，不進行脊髓打擊及術后干預；CsA治療組(CsA組，n=25)：SCI建模后1 h尾靜脈注射2.5 mg/kg體質量濃度CsA；生理鹽水治療組(NS組，n=25)：SCI建模后1 h尾靜脈注射與CsA等體積的生理鹽水。

1.4行為學評分 采用Basso-Beattie-Bresnahan評分法則(BBB score)評估SCI后大鼠后肢運動功能[10]。BBB評分0～21 分，將大鼠后肢運動分為22個等級。術后護理完成后將各組動物置于約2 mm2面積的場地中自由活動5 min，由兩位熟悉掌握BBB評分細則的實驗人員從后肢關節運動、步態、協調運動和精細運動等方面細致觀察大鼠后肢及尾部運動情況并評分，取兩位評分人員的評分平均值作為每只大鼠在每個時間點的最終BBB評分。參照BBB評分細則對各組大鼠于術后1，3，7，14，21，28 d行BBB評分。

1.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 用Trizol溶液提取脊髓組織的總RNA后，按逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit，日本Takara公司)說明操作獲取cDNA，按Real-time PCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM，日本TakaRa公司)進行PCR反應。IL-1β，IL-6及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和GAPDH的引物序列見表1。以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt法將IL-1β，IL-6及TNF-α的Ct值換算成升高或降低的倍數，以sham組各基因的表達作為對照分析qRT-PCR數據。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α.

1.6蘇木精-伊紅(H-E)染色與損傷面積計算 脊髓標本經過常規脫水，透明，包埋后切取橫切片(片厚5 μm)，切片常規脫蠟至水，丙酮固定蘇木精染色，1%鹽酸酒精液分化，伊紅染色，切片脫水，二甲苯中再次透明，中性樹脂封片，晾干后觀察。觀察與評估：光學顯微鏡下觀察并選取高倍鏡視野(×400)拍照，利用photoshop軟件進行高倍鏡照片拼接，IPP 6.0軟件分析各拼接照片的損傷面積和總面積。計算：每張切片的損傷面積百分比=(切片損傷面積/切片總面積)×100%。將損傷面積百分比最大的那張切片定義為該標本的損傷中心。統計分析各組損傷中心H-E染色切片的損傷面積百分比。

1.7免疫組織化學染色 切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶，在檸檬酸鹽(pH=6.0)修復液中95 ℃水浴高溫進行抗原修復，10%山羊血清封閉以減少非特異性染色，滴加一抗IL-1β(1∶500)，IL-6(1∶300)，TNF-α(1∶100)(兔抗大鼠IL-1β，IL-6，TNF-α多克隆抗體為美國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，用PBS替代相應的一抗作陰性對照，滴加生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育15 min，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫下孵育10～15 min，利用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核。光學顯微鏡下觀察，陽性細胞的染色呈棕褐色。每個標本取兩張切片，每張切片取5個不重疊的隨機視野，采用IPP 6.0軟件計數每個視野中的陽性細胞數及總細胞數。每只實驗動物的陽性細胞數為每個視野中陽性細胞個數的平均值。每組實驗動物陽性細胞數為該組該時間點3只實驗動物的陽性細胞數平均值。每個視野的陽性細胞百分比=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。每組實驗動物陽性細胞百分比取該組3只實驗動物的陽性細胞百分比平均值。

1.8統計學處理 除BBB評分數據采用(均數±標準誤)表示外，其余各組數據均采用(均數±標準差)表示，采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，BBB評分采用重復測量方差分析，其余結果采用單因素方差分析。P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1行為學評估結果 SCI后1，3，7，14，21及28 d，觀察各組大鼠后肢運動功能并進行BBB評分。sham組BBB評分21 分，各時間點間比較，差別無統計學意義(P>0.05，圖1)，說明sham組建模成功，未損傷脊髓。SCI后，CsA組及NS組大鼠后肢截癱，BBB評分在所有觀察時間點均顯著低于sham組，差別具有統計學意義(P<0.01，圖1)。隨著觀察時間點推移，CsA組及NS組大鼠后肢運動功能逐漸恢復，兩組的BBB評分在損傷后1，3，7 d比較，差別無統計學意義(P>0.05，圖1)。但CsA組大鼠的BBB評分自SCI后14 d起均顯著高于NS組，差別具有統計學意義(P<0.01，圖1)。

sham組:假手術組;CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組. 與sham組比較，+：P<0.05；與CsA組比較，△：P<0.05.圖1 各組各時間點的BBB評分比較Fig 1 BBB score at each time in each group

2.2SCI晚期H-E染色結果及各組損傷面積比較 SCI后28 d，結束大鼠行為學觀察后，取各組標本行H-E染色并統計損傷面積百分比。sham組未見明顯結構破壞、炎性細胞浸潤、出血、膠質瘢痕形成等病理改變；而CsA組和NS組均可見明顯的程度不等的組織結構破壞、炎性細胞浸潤、膠質瘢痕形成、組織空腔形成等病理改變。SCI后28 d，CsA組及NS組的脊髓組織均有壞死空腔形成，膠質瘢痕包裹，晚期炎癥細胞浸潤等病理改變(圖2)。采用IPP 6.0軟件對損傷中心區的面積進行統計，發現CsA組的損傷面積百分比顯著低于NS組(P<0.01，圖3)。結合BBB評分結果及H-E染色定量結果分析，SCI后大鼠會出現明顯的運動功能障礙及病理性組織損傷，但CsA治療可顯著改善SCI大鼠的運動功能并減輕組織的繼發性損傷。

2.3CsA治療對SCI后大鼠髓內促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA水平的影響 SCI后6 h，CsA組與NS組脊髓組織的IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平均顯著高于sham組(P<0.01)，但CsA組脊髓的IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平卻顯著低于NS組(P<0.01，圖4)。SCI后1 d各促炎因子的mRNA表達趨勢與傷后6 h類似，CsA組與NS組脊髓組織的IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平均顯著高于sham組(P<0.01)，CsA組脊髓的IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平卻顯著低于NS組(P<0.01，圖5)。

A：sham組(假手術組); B：CsA組(環孢素A治療組); C：NS組(生理鹽水治療組).圖2 各組大鼠SCI中心區橫切片比較Fig 2 Contrast of transverse sections of the central area of SCI in rats of each group

sham組:假手術組;CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組. 與sham組比較，+：P<0.05；與CsA組比較，△：P<0.05.圖3 各組大鼠脊髓損傷中心區損傷面積百分比比較Fig 3 Comparison of the percentage of injured area in the central area of SCI in rats of each group

2.4CsA治療對SCI后大鼠髓內促炎因子IL-1β，IL-6及TNF-α蛋白水平的影響 對SCI后6 h各組的免疫組織化學染色切片陽性表達細胞數及總細胞數計數(圖6)。各組各因子的陽性細胞百分比統計顯示，CsA組與NS組脊髓組織的IL-1β，IL-6及TNF-α的陽性細胞百分比均顯著高于sham組(P<0.01)，而CsA組脊髓的IL-1β，IL-6及TNF-α的陽性細胞百分比卻顯著低于NS組(P<0.01，圖7A)。對SCI后1 d各組各因子的陽性細胞百分比統計顯示，CsA組與NS組脊髓組織的IL-1β，IL-6及TNF-α的陽性細胞百分比均顯著高于sham組(P<0.01)，CsA組脊髓的IL-1β，IL-6及TNF-α的陽性細胞百分比卻顯著低于NS組(P<0.01，圖7B)。結合qRT-PCR結果與免疫組織化學半定量結果綜合分析，SCI會誘導明顯的局部炎癥反應，但CsA治療可顯著降低SCI大鼠促炎因子IL-1β，IL-6及TNF-α的表達。

sham組:假手術組; CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組； CsA：環孢素A；IL：白細胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α.與sham組比較，☆:P<0.05.圖4 脊髓損傷后6 h各組大鼠IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平比較Fig 4 6 h after SCI, the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats of each group were compared

sham組:假手術組; CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組； IL：白細胞介素； TNF-α：腫瘤壞死因子-α; CsA：環孢素A. A：脊髓損傷后6 h； B：脊髓損傷后1 d. 與sham組比較，+：P<0.05；與CsA組比較，☆：P<0.05.圖5 脊髓損傷后1 d各組大鼠IL-1β，IL-6及TNF-α的mRNA水平比較Fig 5 1 d after SCI, the levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in rats of each group were compared

3 討 論

促進SCI后神經功能恢復的藥物治療，既要能夠避免殘存的神經元受原發性損傷的波及，又要促進損傷組織的修復[11-12]。許多學者已探討如何減輕SCI所誘導的組織損傷機制[13-15]。但至今仍然沒有有效的治療手段能減輕繼發性SCI。甲基強的松龍為一種合成的糖皮質激素，能夠直接抑制脂質過氧化反應，減輕神經元凋亡，促進SCI后的神經功能恢復[16-20]。目前甲基強的松龍對人類SCI后神經功能恢復的有利效應尚未被完全證實[21-25]。研究表明，免疫抑制劑CsA及他克莫司(FK-506)這兩種磷酸酶抑制劑對中樞神經系統創傷有潛在的神經保護作用[26-27]。CsA是一類含11個氨基酸的環狀多肽，可選擇性抑制T淋巴細胞增殖，減輕機體免疫反應。CsA已被證實具有抵抗寄生蟲、促進肝細胞及神經元再生和神經保護作用[28]。而CsA的神經保護作用主要是通過抑制脂質過氧化反應而發揮[29]。

研究發現，無論是SCI還是腦損傷，CsA能減少促炎因子、自由基及一氧化氮合酶的產生，同時也可以抑制小膠質細胞和巨噬細胞的活化，減少細胞凋亡，起到保護神經作用[30-33]。不僅如此，CsA還可維持線粒體內Ca2+穩態及膜電位，從而為受損神經細胞提供能量，也可以通過抑制水通道蛋白-4在神經細胞的表達來減輕神經細胞水腫。同時，CsA不僅能夠降低損傷后血腦屏障的通透性，還能夠抑制天門冬氨酸介導的神經毒性。因此，CsA能夠通過脊髓繼發性損傷的各個環節發揮其保護神經作用。CsA作為一種臨床常用的免疫抑制劑，主要通過調控炎癥反應而發揮各種生物學效應。

炎癥反應是把“雙刃劍”，炎癥因子包括兩大類即促炎因子和抗炎因子，促炎因子包括IL-1β，IL-6及TNF-α，而抗炎因子(包括IL-4，IL-10，IL-13，TGF-β)抑制SCI后的繼發性炎癥反應是減輕脊髓繼發性損傷的重要措施。本研究發現，無論是SCI后6 h還是傷后1 d，各促炎因子的mRNA表達水平均升高，促炎因子IL-1β，IL-6及TNF-α表達水平的升高可使損傷的脊髓出現水腫及局部炎癥反應，增加炎性細胞的浸潤，抑制SCI后的神經功能恢復，而且各促炎因子之間可相互作用導致更強烈的的炎癥級聯效應，加重SCI。CsA為鈣依賴磷酸酶抑制劑，特異性抑制T淋巴細胞活性，既可抑制宿主細胞免疫也可抑制體液免疫，CsA進入細胞內形成復合物與鈣依賴磷酸酶結合，抑制其活性，因此抑制IL-1β，IL-6及TNF-α等促炎因子的基因轉錄，干擾T細胞活化，抑制IL-1β，IL-6及TNF-α等毒性細胞因子的產生。既往的SCI的熱點研究主要集中在軸突的再生及干細胞的移植等方面，本研究創新運用臨床上常見的免疫抑制藥物CsA，取材方便，應用CsA能減輕神經炎癥反應，而不是研究如何消除膠質瘢痕、重建脊髓微循環、重構髓鞘等目前尚存爭議的問題，取得了預期的實驗效果。

sham組:假手術組; CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組; IL：白細胞介素； TNF-α：腫瘤壞死因子-α；sham組：假手術組； CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組.圖6 脊髓損傷后6 h各組大鼠IL-1β，IL-6，TNF-α的免疫組織化學比較Fig 6 6 h after SCI, immunohistochemical comparison of IL-1β,IL-6,TNF-α in rats of each group

sham組:假手術組; CsA組:環孢素A治療組; NS組:生理鹽水治療組; IL：白細胞介素； TNF-α：腫瘤壞死因子-α. A：脊髓損傷后6 h；B：脊髓損傷后1 d. 與sham組比較，+：P<0.05；與CsA組比較，☆：P<0.05.圖7 脊髓損傷后6 h及1 d各組大鼠IL-1β，IL-6及TNF-α的蛋白水平比較Fig 7 6 h and 1 d after SCI, comparison of protein levels of IL-1β,IL-6,TNF-α in rats of each group

與以往的研究比較，本研究發現，CsA可促進SCI大鼠的運動功能恢復并減輕脊髓組織的進一步病理性損傷，通過SCI面積比較，發現CsA治療可減輕脊髓的病理損傷程度；通過損傷脊髓的促炎因子mRNA水平比較，發現SCI可誘導大量促炎因子的轉錄，且CsA治療可降低SCI后6 h及1 d的髓內促炎因子的轉錄水平及局部炎癥反應。SCI的急性期，在損傷局部確實存在劇烈的炎癥反應，而CsA治療可顯著抑制促炎因子的mRNA表達及局部炎癥反應；通過損傷脊髓的促炎因子的蛋白水平比較，發現SCI可誘導大量促炎因子的蛋白表達，而CsA治療可降低髓內促炎因子的蛋白表達及局部炎癥反應；免疫組織化學的半定量蛋白水平結果提示，無論是SCI后6 h還是傷后1 d，各促炎因子的蛋白表達均升高，這說明SCI的急性期在損傷局部存在劇烈的炎癥反應，而CsA治療可顯著抑制促炎因子的蛋白表達及局部炎癥反應。CsA治療有利于SCI的恢復，是一種用于減輕神經損傷的切實可行的治療方法，同時也探討了CsA對SCI后炎癥反應的影響，發現CsA可減少損傷局部促炎因子的表達，從而在中樞神經系統創傷后發揮抗炎及神經保護作用。