紫錐菊提取物對環磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能影響研究

宋紅衛，張惠喜，朱麗君，魏戎蓉，姜祎頔，郭靈玲

（1.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；2.菏澤信息工程學校，山東 菏澤 274000）

長期以來，中小規模養殖場的生產設施相對落后及缺乏畜禽養殖專業知識，養殖場為了預防生產中動物疾病的發生，長期和大量的使用動物保健藥物，造成畜禽機體處于應激狀態甚至免疫抑制情況的發生。因此，科研人員研發了各種免疫調節劑，以應對生產中出現的這些問題。隨著農產品中殘留化合物監管的日益廣泛和嚴格，天然的植物藥物成為理想的選擇。紫錐菊（Echinacea）是原產于美洲的一類菊科野生花卉，作為免疫調節劑在國際上受到普遍重視，在美洲作為免疫促進劑和調節劑用于流行感冒的治療[1]。對免疫力低下的生理狀態有比較理想的免疫作用效果。本試驗通過研究紫錐菊提取物對環磷酰胺免疫抑制小鼠免疫調節作用，為開發新型、安全、低毒的畜禽免疫調節劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

SPF級昆明小鼠150只，雄性，體重18～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.1.2 藥材與試劑

紫錐菊提取物，HPLC檢查，指紋圖譜與紫錐菊提取物對照品圖譜吻合。含量測定：菊苣酸≥2.0%，多酚≥4.0%。印度墨汁、RPMI1640細胞培養液、Hank's平衡鹽溶液、胎牛血清、刀豆蛋白A（ConA）、MTT、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑，綿羊紅細胞（SRBC）。

1.1.3 儀器設備

二氧化碳培養箱（德國BINDER，C170）；紫外可見分光光度計（日本島津公司，UV-2700）；高壓蒸汽滅菌器（濟南德強儀器有限公司，MJ-3780D）；酶標儀（瑞士Tecan，Infinite 200 Pro）；離心機（sigma公司，3K15）；顯微鏡（日本Olympus，CX31）；恒溫水浴鍋（上海科恒實業發展有限公司）；電子天平（UX820S，日本島津公司；XS-105，梅特勒公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥

試驗小鼠50只，分為正常對照組、免疫抑制對照組、紫錐菊提取物高、中、低劑量組，每組3個重復，每個重復10只。除正常對照組外，各組小鼠腹腔注射環磷酰胺（100 mg·kg-1BW），1次·d-1，連續3 d，建立免疫抑制模型小鼠[2]。建模后高、中、低劑量組分別按240、120、60 mg·kg-1BW水平添加紫錐菊提取物，正常對照組、免疫抑制對照組給予等量的純化水，以20 mL·kg-1BW灌胃體積，1次·d-1，連續30 d后測定各項免疫指標。分別進行免疫器官指數及碳廓清試驗、血清溶血素值的測定、脾淋巴細胞增殖轉化實驗。

1.2.2 碳廓清試驗及免疫器官指數測定

印度墨汁原液用生理鹽水稀釋4倍，各組小鼠尾靜脈注射10 mL·kg-1BW，注射墨汁后2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，立即加入2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以0.1%Na2CO3溶液作溶劑對照，600 nm波長處測定各試驗組光密度值（OD）。采血結束，稱重后頸椎脫臼處死小鼠，取出胸腺、肝臟和脾臟，去掉筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重，計算吞噬指數（a），同時計算胸腺/體重比值與脾臟/體重比值。

1.2.3 半數血清溶血素值（HC50）測定

每只小鼠腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL，致敏后5 d，摘除眼球取血，2 000 r·min-1離心10 min，收集血清。將血清用SA緩沖液稀釋200倍，測定半數溶血值（HC50）。

1.2.4 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖轉化實驗

無菌取脾，置于盛有Hank's液平皿中，用鑷子將脾磨碎，經過200目篩網過濾，用Hank's液洗2次，1 000 r·min-1離心10 min。將細胞懸浮于1640完全培養液中，調整細胞密度為3×106個·mL-1。將每1份脾細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1 mL，1孔加入ConA液75 μL，另1孔作為對照，置于5%CO2、37℃培養箱中培養72 h，培養結束前4 h，每孔輕輕吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI1640培養液，同時加入5.0 mg·mL-1的MTT溶液50 μL，繼續培養4 h。培養結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解，然后分裝到96孔培養板中，每孔作3個平行孔，570 nm波長測定光密度值（OD值）。

2 試驗結果

2.1 紫錐菊提取物對小鼠碳廓清能力的影響

紫錐菊提取物對小鼠碳廓清能力的影響見表1。

表1 紫錐菊提取物對小鼠碳廓清能力的影響

由表1可見，免疫抑制對照組的碳廓清能力顯著低于正常對照組（P＜0.05）。給予環磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，各劑量組均能恢復免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，低劑量組恢復能力與免疫抑制組比較差異不大（P＞0.05），中、高劑量組恢復能力與免疫抑制組比較有顯著性增高（P＜0.05），而且中劑量組能夠恢復到正常的水平。

2.2 紫錐菊提取物對小鼠免疫器官指數的影響

紫錐菊提取物對免疫器官指數結果的影響見表2。

表2 對免疫器官指數結果的影響mg·g-1

由表2可見，免疫抑制對照組的胸腺和脾臟指數顯著低于正常對照組（P＜0.05）。給予環磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低，中、高各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾臟指數（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 紫錐菊提取物對小鼠血清溶血素值的影響

紫錐菊提取物對小鼠血清溶血素值的影響見表3。

表3 對小鼠血清溶血素值的影響

由表3可見，免疫抑制對照組的血清溶血素值顯著低于正常對照組（P＜0.05）。給予環磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低劑量組血清溶血素值與免疫抑制組比較差異不顯著（P＞0.05），中、高劑量組血清溶血素值與免疫抑制組相比較顯著提高（P＜0.05）。

2.4 紫錐菊提取物對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞增殖轉化結果的影響

紫錐菊提取物對對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化結果的影響見表4。

表4 對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化結果的影響

由表4可見，免疫抑制對照組的脾淋巴細胞轉化結果顯著低于正常對照組（P＜0.05）。給予環磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低、中劑量組脾淋巴細胞轉化結果與免疫抑制組比較差異不顯著（P＞0.05），高劑量組脾淋巴細胞轉化結果與免疫抑制組相比顯著提高（P＜0.05）。

3 討論

紫錐菊別名紫松果菊，花托為圓錐形，因其頭狀花序形似松果而得名，其主要功能成分為多糖、烷基酰胺類化合物和咖啡酸類衍生物[2]。吳江濤等研究顯示，紫錐菊提取物可以增強氫化可的松免疫抑制小鼠的單核巨噬細胞吞噬功能[3]。王樹琴等研究表明，紫錐菊提取物對肉雞體液免疫和細胞免疫均具有促進作用[4]。巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，其吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一，小鼠碳廓清試驗中所測得的吞噬指數可反映單核-巨噬細胞的吞噬能力[5-6]。本試驗結果表明，各劑量組均能恢復免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，中、高劑量組恢復水平與免疫抑制組比較顯著提高（P＜0.05），而且中劑量組能夠恢復到正常的水平，其原因可能與中草藥免疫調節作用的雙向性有關。

免疫器官按其功能可分為中樞免疫器官和外周免疫器官，胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其臟器系數在一定程度上可以反映機體的免疫功能[8]。本試驗結果表明，紫錐菊提取物低，中、高各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾臟指數。血清溶血素試驗和脾淋巴細胞轉化試驗是評價機體體液免疫和細胞免疫功能的經典試驗，試驗結果表明，中、高劑量組血清溶血素值與免疫抑制組比較有顯著性提高，高劑量組脾淋巴細胞轉化結果與免疫抑制組比較有顯著性提高。表明紫錐菊提取物可增強免疫抑制小鼠的體液和細胞免疫水平，其免疫調節作用可能與紫錐菊提取物能夠增強淋巴細胞功能，刺激細胞因子和抗體的產生有密切關系，其相應的復雜藥理機制還需進一步研究[7]。

4 結論

紫錐菊提取物具有調節環磷酰胺免疫抑制小鼠非特異性和特異性免疫的作用，是一種效果極好的免疫調節劑，如果能夠在生產中合理使用，可以很好地增加疾病的預防效果。