心肌內質網應激致心律失常的作用機制研究進展

周亞飛 綜述，李濤 審校

（西南醫科大學：1心血管醫學研究所，2醫學電生理學教育部重點實驗室，四川瀘州 646000）

1 心律失常概述

1.1 心律失常的產生和分類

功能正常的竇房結作為心臟的起搏器，興奮產生去極化，然后興奮通過房室傳導系統和浦肯野氏纖維傳布至全心。心臟通過有規律和節奏的收縮將血液輸送到全身各個組織器官。當竇房結興奮出現異常、興奮傳導速度減緩或阻滯、興奮產生在竇房結以外其他部位，就會引起心臟觸發活動以及傳導功能障礙，表現為心臟節律異常，即為心律失常[1]。

心律失常多合并或繼發于心肌肥厚、心肌缺血、心肌纖維化等心血管疾病。臨床上按心律失常發作時心率快慢分為快速性、緩慢性心律失常兩類，前者常見于心房和心室顫動、心動過速或早搏等；后者多見于竇性心率緩慢性心律失常和多種傳導阻滯等[2]。心律失常的患者可能會出現心悸、乏力等臨床癥狀，甚至會導致患者心源性暈厥和猝死[1]。目前心律失常的治療仍然是臨床上的一大難題，究其原因在于發生發展過程中存在復雜的電與結構重構改變，但是對心律失常疾病的發生發展機制認知還存在不足。因此對心律失常發生機制的深入研究一直是心血管領域的難點。

1.2 心律失常的發病機制

竇性心律的產生不僅需要竇房結的正常起搏，還依賴于傳導系統和心肌細胞正常的電生理特性。心肌細胞動作電位是鈉離子、鉀離子、鈣離子等多種離子通道共同參與的結果[3]。心臟鈉通道主要參與動作電位去極化過程，鉀通道和鈣通道主要參與動作電位的復極化過程，鈣通道和鈉鈣交換體參與心肌興奮-收縮耦聯過程。這些離子通道的變化可能通過改變去極化和復極化過程中離子之間的動態平衡，導致動作電位時程的縮短或延長，而動作電位時程的改變是心律失常發生的重要病理生理基礎之一[4]。心肌細胞離子通道功能異常引起的心電紊亂可能會直接誘發心律失常的發生。既往研究表明，房顫時心肌細胞多種離子通道，包括L 型鈣通道（ICa-L）和內向整流鉀通道（IK1）、瞬時外向鉀通道（Ito）、延遲整流鉀通道（IKS）、乙酰膽堿敏感鉀通道（IK-ACh）等多種鉀通道發生改變[5-7]。這些都表明離子通道電流的改變是心律失常發生的重要病理生理基礎[8]。因此，探索心臟離子通道功能及異常調控機制，有助于探討心律失常的發生機制及尋找新的干預靶點，對于預防和治療心律失常具有重要的理論基礎和臨床意義。

以往的研究提出了多種心律失常的發病機制，包括β -腎上腺素能受體信號傳導脫敏，心肌細胞興奮-收縮耦聯調節異常等[9]。也有研究表明心肌細胞凋亡引起心臟不可逆的收縮功能障礙，導致心律失常的發生、維持和進展[10]。因此，了解心律失常的病理生理機制對發現安全有效的新療法至關重要。

2 內質網應激概述

內質網是細胞內的膜性管道系統，它是由生物膜構成的連通的片層小管或隙狀系統，構成了細胞內的物質運輸通路，也是細胞內鈣離子重要的儲存場所，同時也為細胞內酶反應提供場所[11]。內質網是細胞內的細胞器，完成蛋白質合成、折疊和組裝，然后將其輸出到高爾基體、細胞質和質膜[12]。內質網是合成蛋白質并使合成的蛋白質由一級結構變成具有生理功能的結構場所。并且，內質網對脂質的生物合成有著重要的生理作用，包括對脂膜的合成、膽固醇以及其他脂膜成分的控制[13-14]。有分子生物學研究提示，所有通道蛋白的組裝、變構都是在內質網中完成的，是離子通道轉運到細胞膜之前的重要場所。因此，內質網內環境的穩態是離子通道發揮正常功能的前提[15]。

2.1 內質網應激反應的產生

內質網是細胞中發揮重要生理功能的細胞器，當氧化應激、病毒感染、缺氧缺血等因素導致內質網穩態失衡時，內質網異常聚集錯誤折疊蛋白并引起內質網應激[16]，伴侶蛋白分泌增加等反應。迄今為止的研究認為，細胞接受外界刺激時發生的最初反應是內質網應激，屬于細胞的自我保護性反應。內質網應激同時也是一種信號反應通路系統，與多種基因的表達和調控有密切關系[17]。內質網應激反應可分為三種類型，分別是過度負荷反應、固醇級聯反應、未折疊蛋白質反應（unfolded protein response，UPR）。其中UPR 是介導內質網應激反應中最重要的信號機制，因此常用參與的蛋白分子作為內質網應激反應發生的標志，蛋白激酶樣內質網激酶（PERK）、激活轉錄因子6（ATF6）和肌醇需要酶1（IRE1）則是內質網應激反應三條信號通路的重要標志性蛋白分子[18]。

在細胞正常生理狀態下，這三種明星蛋白分子以無活性狀態與伴侶蛋白——葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated proteins78，GRP78）相結合。GRP78可與免疫球蛋白結合蛋白（immunoglobulin-binding protein，Bip）結合形成復合物GRP78/Bip，GRP78/Bip是UPR的主要調節分子，它的表達水平對維持內質網功能、緩解內質網應激和保護細胞免于損傷有重要作用。細胞受到應激后，未折疊蛋白與錯誤折疊蛋白合成量超出內質網正常的生理容量，GRP78/Bip與三種應激感受的蛋白分子PERK、IRE1和ATF6解離，并與非折疊蛋白結合，通過結合到新生蛋白暴露的疏水性殘基上來增加內質網的蛋白折疊能力，減少錯誤折疊蛋白的堆積從而確保蛋白質正確折疊并防止蛋白質聚集。在過去的20年中，臨床研究和動物實驗均證實內質網應激在缺血/再灌注[19]、擴張性心肌病、心肌梗死、高血壓、糖尿病性心肌病[20]和心力衰竭[21]等心血管疾病中均有報道[22-23]。

近年來，內質網功能受損引起的細胞凋亡越來越引起關注。廣泛認可的內質網凋亡通路有三條：包括CHOP 基因的激活轉錄通路、C-jun 氨基末端激酶（JNKs）的激活通路、半胱氨酸天冬氨酸酶12（Caspase-12）的激活通路。CHOP基因的激活轉錄通路是轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白家族成員之一[24]。該通路通過下調Bcl-2表達、耗竭谷胱甘肽、促進活性氧產生等導致細胞凋亡，以清除無法恢復正常功能的受損細胞。C-jun 氨基末端激酶（JNKs）的激活通路是指在應激狀態下，IRE1被激活，通過腫瘤壞死因子受體相關因子 2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）和凋亡信號調節激酶1（ASK1），形成IRE1-JNK-TRAF2-ASK1 復合物，導致ASK1 激酶活化，并導致JNK促凋亡信號轉導通路的活化，將信號傳遞給胞核內的組分，最終通過核轉錄因子來調控細胞的表達[25-26]。半胱氨酸天冬氨酸酶12（Caspase-12）是內質網應激細胞凋亡獨有的標志物。Caspase-12 是只存在于內質網膜上且被內質網應激所活化的蛋白水解酶。活化的Caspase-12 可以啟動正反饋回路，通過剪切活化Caspase-9，導致下游具有降解細胞結構的Caspase-3 的裂解活化，通過引發一系列級聯反應誘導細胞凋亡[27-28]。

2.2 內質網應激的信號通路組成

內質網應激主要由三種信號通路組成：IRE1信號通路、PERK信號通路和ATF6信號通路[29]。

IRE1作為一種特有的I型跨膜蛋白激酶，它介導的信號通路是內質網應激機制中的重要途徑之一。IRE1含有特異的RNA 內切酶活性的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）受體蛋白激酶位點，是內質網應激重要的效應感受器。在細胞靜息狀態下，IRE1與GRP78/BiP結合來維持IRE1的單體和非激活狀態。當內質網應激發生時，未折疊蛋白不斷堆積，GRP78/BiP 與IRE1 解離，IRE1 改變了原有的空間結構而自身發生寡聚化和磷酸化激活而形成二聚體，這是許多UPR 相關基因的關鍵轉錄活化因子，可以促進內質網甘露糖苷酶蛋白的表達，上調內質網降解相關基因的轉錄，識別UPR 的蛋白質，提高內質網對蛋白質的折疊修飾能力，啟動蛋白降解信號通路，在輕中度的內質網應激時起到保護細胞的作用[30]。

PERK 介導的生存信號PERK-eIF2α 途徑是內質網應激信號通路之一[31]。PERK 與IRE1 都屬于I 型跨膜蛋白，是一類具有胞質激酶結構域和N-末端腔內應激信號傳感結構域的內質網駐留蛋白質。當內質網應激發生時，游離的PERK氨基酸末端結構改變而磷酸化，導致其激酶結構域被激活，進一步活化eIF2α 氨基端的第51位絲氨酸。在蛋白合成的初期，磷酸化的真核細胞翻譯起始因子2 與GTP 及tRNA 形成三聚體復合物，無法感應和觸發GTP-GDP 的交換反應，阻斷了起始蛋氨酸-RNA 與核糖體的結合，使細胞內蛋白質翻譯起始無法進行。因此，在內質網應激早期可以減少內質網內新生蛋白質的合成，有研究表明這也是內質網應激調控蛋白質表達速度最有時效的方式和反應。

內質網應激的另一反應途徑是由ATF6 轉導的[32]。ATF6 是一個內質網型的跨膜蛋白，屬于堿性亮氨酸拉鏈的轉錄因子家族。正常情況下存在于內質網中有兩種構型，分別是ATF6α 和ATF6β，兩者都屬于環磷腺苷效應元件結合蛋白轉錄因子家族成員，其氨基端胞質區有一個堿性亮氨酸拉鏈的DNA 轉錄激活域。ATF6存在于內質網膜，其內質網腔區的結構域與GRP78 結合，發生內質網應激時，ATF6 與GRP78解離，游離ATF6被激活產生有活性的ATF6α 片段，有活性的片段被轉移到細胞核內，正調節UPR基因的轉錄，誘導啟動Bip、XBP1、CHOP等這些蛋白的轉錄表達。

3 心肌內質網應激與心律失常的研究進展

3.1 輕度的內質網應激對心肌細胞的保護作用

在內質網應激剛發生時，GRP78/Bip由于誘導表達且具有抗細胞凋亡的作用。為了減輕內質網的負擔，UPR 主要通過PERK 和IRE1 通路增加蛋白的mRNA 降解，抑制蛋白的翻譯，加速蛋白的降解[31]。PERK 發揮內質網應激感應作用，可以減輕內質網應激損傷從而抑制心肌細胞凋亡，在減緩心力衰竭進程中發揮重要作用。血小板反應蛋白4是內質網應激反應的效應分子，可以活化ATF6α 從而提高內質網中質量控制蛋白的表達，更有助于其產生復雜的保護性分子伴侶，發揮保護心肌細胞的作用。

內質網應激反應可以激活自噬溶酶體通路[33]，在心臟的疾病與預后方面有著末端執行器的作用。自噬是真核細胞維持蛋白質穩態的關鍵，是一種進化上保守的蛋白降解途徑。自噬通過吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并將其包裹進入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以此來清除受損或失效的細胞或蛋白。已有研究報道在多種病理性心臟組織的超微結構中均可以觀測到心肌細胞的自噬作用[34]。在心臟某些應激情況下，血管壁的自噬會發生改變，在一定范圍內可以加快血管內物質代謝的循環速度，對血管壁起到積極的保護作用。因此可以推測，一定水平的內質網應激引起的自噬在心肌細胞損傷時可以在功能以及結構上對其起到良好的保護作用。

3.2 過度的內質網應激會加重心律失常

盡管UPR 主要是促生存反應，但是持續而嚴重的內質網應激超出了內質網的限度及處理能力，內質網穩態不能恢復的情況下，為了保護細胞其他的生理功能則觸發內質網相關細胞凋亡，造成心肌由代償走向衰竭。心肌細胞幾乎沒有復制和再生的潛力，屬于終末分化的細胞。若心肌細胞不斷凋亡，則會引起心臟泵血功能下降，心臟功能從代償走向失代償。而蛋白質生產、功能和分解的穩態被破壞，會導致心肌細胞減少，進一步誘發心律失常[35]。因此心肌細胞內穩態的嚴格調控和蛋白質質量的精準控制，以及內質網穩態對心肌細胞發揮正常生理功能有無可替代的作用[12]。當心臟的前后負荷過重、心肌缺血、氧化應激或炎癥反應、離子通道功能失常等現象出現時，細胞內穩態被破壞，發生應激而引發未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白堆積，內質網應激及相關的細胞凋亡，造成心臟不可逆的收縮功能障礙，介導心律失常的起始、維持和進展，參與多種心血管疾病發生過程，是影響心律失常發生發展的重要因素。

研究證明內質網應激與心肌細胞的電重構及心肌病密切相關。有研究證實，細胞炎癥信號因子引起的內質網應激導致Kv4.2 通道蛋白表達量下降以至動作電位復極化延長，在加入內質網應激保護劑后通道電流有所恢復。所以內質網穩態對心肌細胞的動作電位有著重要的作用[36]。內質網分為兩種，包括粗面內質網和光面內質網，心肌細胞的光面內質網也被稱為肌漿網，是胞內重要的鈣庫，用以維持心肌細胞收縮時所必需的最合適的鈣水平。近年來，UPR 被報道可調節多種心臟離子通道[6]，如UPR激活后導致Nav1.5翻譯后修飾以及相關輔助亞單位的改變[30]，PERK 信號通路下調Nav1.5、Kv4.3、hERG 等離子通道在膜上的表達導致心律失常。

心臟離子通道和轉運蛋白的改變是心律失常風險增加的重要因素[36]。內質網應激反應導致離子通道蛋白在內質網中錯誤折疊而堆積過多，離子通道蛋白從內質網向胞漿和細胞膜轉運障礙，引起離子通道蛋白在膜上表達異常會導致心肌細胞動作電位時程和形態發生改變，從而引起心律失常的發生。在人類心衰的模型中，異常剪接變體SCN5A 的α亞基編碼心臟Nav1.5升高，導致非功能性通道蛋白質停留在內質網中，而正常Nav1.5 蛋白在細胞膜上表達下調，導致鈉離子通道的電流密度顯著降低，從而導致傳導速度降低改變了動作電位的時程[4]。未在細胞膜上表達的通道蛋白并非完全喪失功能，若能正常轉運至細胞膜上依然能發揮一定的代償功能。因此，內質網應激引起離子通道蛋白在內質網中的產生、折疊發生異常是離子通道功能改變的重要病理生理基礎[37]。

細胞膜離子通道的功能在很大程度上依賴于其在細胞膜上表達的豐度。因此，糾正蛋白質的錯誤折疊和轉運也是干預內質網應激的過程，增加相關蛋白從內質網向胞漿或細胞膜上的轉運，可以在一定程度上恢復其功能。

多種心臟疾病的發生發展都伴隨著不同程度的心肌細胞纖維化[38]，而內質網應激會引起和促進心肌細胞凋亡，導致心臟成纖維細胞增生，進而轉化為肌成纖維細胞并在細胞外基質沉積，從而細胞間的縫隙連接發生改變，導致心肌纖維化。由于心肌細胞和成纖維細胞的靜息膜電位水平不同，兩類細胞間形成的電耦聯會影響心肌細胞離子通道電活動，改變心肌細胞的去極化過程和電活動傳導速度[39]，進而引起心律失常的發生[40]。

4 結論

心肌細胞在某些病理條件或應激狀態下導致內質網應激，從而引起UPR 激活，這是細胞自身的一種保護性反應，適度的內質網應激有利于心肌細胞代償，但是持續而嚴重的內質網應激則觸發內質網相關細胞凋亡，導致心肌細胞多種離子通道表達改變。離子通道表達異常對心肌細胞動作電位的去極化和復極化過程會有影響，會造成心肌功能由代償轉向失代償，心律失常發生率的風險明顯增大。研究內質網應激與心律失常的關系，可以更好地了解離子通道在心肌細胞的表達水平以及信號傳導途徑，保證心肌細胞正常的電活動，從而使心臟維持正常的竇性心律。因此，研究心肌細胞內質網應激發生機制和發展過程對保護心肌細胞，干預心律失常有重要的指導意義。深入探索內質網應激，這可能代表一種新的、潛在的有效的抗心律失常的方式，將對心律失常的臨床治療和藥物開發提供新的方向。