弱精子癥分子遺傳學的研究進展

張國暉，梁高照綜述；汪 清審校

(1.廣東醫科大學，廣東湛江 524000;2.廣東醫科大學深圳寶安臨床醫學院/深圳大學第二附屬醫院/深圳市第八人民醫院/深圳市寶安區人民醫院，廣東深圳 518100)

弱精子癥(asthenozoospermia,AZS)是指精子活力PR級(a級+b級)<32%的病癥，主要依靠常規精液分析進行診斷，是男性不育最常見的類型。常規精液分析是判斷男性生育能力及診斷AZS的臨床指標，但不能解釋精子運動缺陷的根本原因。AZS病因眾多，目前尚未闡明AZS形成的根本機制。精子的運動功能是由無數基因和各種信號通路共同協調的，目前普遍認為，分子遺傳學改變是AZS發生的中心環節。近年來，隨著高通量測序和基因芯片技術的發展，目前已經發現部分基因改變及基因調控異常在AZS形成中發揮關鍵作用，包括精子鞭毛相關基因突變、線粒體DNA突變、miRNA調控異常及端粒長度改變。本文重點討論國內外關于AZS分子遺傳學改變的最新研究進展。

1 基因突變

精子鞭毛多發性形態異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)是一種嚴重的精子鞭毛畸形，包括缺失、盤繞、彎曲、有角度、不規則和短鞭毛[1]。精子運動主要依靠鞭毛擺動提供前進動力。MMAF是降低精子運動力和活力的重要器質性病變。基因突變是引起MMAF的主要原因，目前研究發現大范圍核苷酸缺失插入和單核苷酸突變均能導致鞭毛形態異常。

既往只有AKAP4、CCDC39和DNAH1三種基因被認為是MMAF相關基因[2-4]，其中DNAH1突變是主要因素，約占MMAF的28%～44%[1-2]。早在2001年，NEESEN等[5]就報道DNAH1基因突變能引起纖毛擺動頻率降低和AZS。近年來，越來越多文獻報道DNAH1基因突變引起MMAF及AZS[6]。DNAH1是一個含有78個外顯子的基因，編碼內臂動力蛋白重鏈，參與形成鞭毛中心結構。DNAH1基因突變導致內臂動力蛋白形成及功能障礙，引起精子鞭毛多發性形態異常、精子纖維鞘發育不良(dysplasia of sperm fibrous sheath,DFS)、精子運動障礙及男性不育。DNAH1基因高度表達于睪丸，突變不引起體表纖毛功能改變[1]。據報道，鞭毛異常與非整倍體頻率升高和卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)療效差有關。然而，最近一項研究顯示，DNHA1突變的MMAF患者具有較低的非整倍體率和較高的DNA完整性，DNAH1突變MMAF患者與非MMAF患者相比，接受ICSI治療后的受精、妊娠和活產率并沒有統計學差異[7]。這表明并非所有MMAF患者都存在染色體畸形，同時也為DNHA1突變患者的治療提供了新的見解。

近2年來，研究發現CFAP43、CFAP44、CFAP69及CFAP251也是引起MMAF的基因之一[8-11]。TANG等[12]首次表明CFAP43和CFAP44中的雙等位基因突變可導致MMAF并損害精子活力。CFAP43(也稱為WDR96)位于10號染色體上，含有38個外顯子，編碼含1 665個氨基酸的蛋白質。CFAP44(也稱為WDR52)位于3號染色體上，含有35個外顯子，編碼含1 854個氨基酸的蛋白質[11]。其編碼的蛋白質TbCFAP43和TbCFAP44含有WD重復結構域(WDR)，比如N-末端區域共有β-鏈結構域，C-末端區域共有α-螺旋結構域，集中表達于鞭毛軸絲微管5、微管6和副鞭毛竿之間，精細調控該區域的蛋白質復合物，在維持軸絲超微結構中具有重要作用[11]。CFAP43和CFAP44基因突變誘導鞭毛軸絲解體，引起MMAF，表明CFAP43和CFAP44是精子鞭毛組裝和穩定性所必需的基因，與精子鞭毛缺陷和AZS相關[11]。CFAP43和CFAP44不表達于體表細胞纖毛，突變不會引起原發性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia,PCD)[12]。CFAP43和CFAP44突變的MMAF患者通過ICSI治療可獲得較為滿意的妊娠率[13]。CFAP69高度表達于睪丸，編碼位于鞭毛中段相對保守的蛋白質，CFAP69的完整表達對于鞭毛組裝及穩定結構是不可或缺的，CFAP69雙等位基因突變不會影響精子發育過程，但能夠引起精子頭部嚴重畸形及鞭毛嚴重缺陷，導致常染色體隱性MMAF和原發性不育[8]。CFAP251編碼位于外周微管雙層內表面蛋白質，在穩定RS3結構和控制鞭毛運動中起重要作用，CFAP69突變影響精子線粒體鞘形成、鞭毛形態，導致男性不育[9-10,14]。此外，腺苷酸激酶7中的純合錯義突變L673P也會引起MMAF和導致男性不育，并且不導致PCD[15]。

單核苷酸多態性主要是指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，也是引起AZS的突變類型。白細胞介素(interleukin-1α，IL-1α)被認為是精原細胞的生長因子，參與精子發生。一項關于伊朗男性IL-1ɑC376A單核苷酸突變的研究[16]發現，C等位基因突變與AZS相關；另一項對IL-1ɑ4845G> T的遺傳關聯研究[17]顯示，GT基因型、TT基因型、T等位基因與特發性男性不育之間存在相關性，4845TT基因型和4845T等位基因與少精子癥、AZS和非阻塞性無精子癥有關。然而這兩項研究僅僅是初步研究，有待進一步驗證及闡明機制；同時鑒于不同地理區域的環境因素不同，因此在不同種族和人群中進行更大樣本規模的研究是很必要的。此外近來發現GRP78啟動子突變[18]、FSIP2突變[19]也是引起AZS的重要因素。

2 線粒體DNA突變

線粒體(mitochondrial)是精子能量的加工廠，通過有氧氧化為精子生長發育、運動和受精等各個階段供應能量，對精子活力和生育能力至關重要。線粒體DNA(mtDNA)缺失或突變通常導致精子活力下降，最后導致精子功能障礙和男性不育[20-22]。AMBULKAR等[23]發現AZS患者存在mtDNA7436-bp缺失，盡管mtDNA7436-bp缺失頻率較低，但對照組并沒有顯示mtDNA缺失。這表明mtDNA7436-bp缺失與精子活力低下相關，是精子功能障礙和無運動精子的重要原因之一。GHOLINEZHAD等[24]研究發現，AZS患者和正常可育受試者中均存在mtDNA4866-bp、mtDNA4977-bp和mtDNA7436-bp缺失，但AZS中多個mtDNA缺失的頻率顯著高于正常受試者。研究結果表明mtDNA的大規模缺失與精子活動性降低和精子形態異常之間存在關聯，尤其是AZS患者。一項關于伊朗男性不育人群的mtDNA分析表明mtDNA7599 bp缺失與男性不育有關，然而這只是一項初步研究，有待進一步驗證[25]。綜合目前研究結果[26-27]，mtDNA缺失導致精子運動性及活力下降的機制如下：第一，大規模mtDNA缺失致使其部分結構基因和tRNA基因完全缺失或截斷表達，從而導致功能障礙；第二，含有mtDNA缺陷的精子進行氧化磷酸化活動時，不僅不能有效地生成ATP，反而會產生更多活性氧和自由基，進一步損害線粒體，同時促進mtDNA突變或缺失，最終導致精子能量危機、精子活力和生育力下降；第三，大規模mtDNA缺失在精子發育過程中形成并不斷積累，最終損害呼吸功能并降低精子活力，這可能是男性生育能力下降甚至人體某些病理條件的重要因素之一。

除了mtDNA大范圍缺失突變外，mtDNA單核苷酸點突變也會對精子質量產生影響。一項針對中國男性線粒體DNA的新一代測序(next-generation sequencing,NGS)及單核苷酸分析研究[28]顯示，病例組C16179T基因突變發生率明顯高于對照組，并引起精子總數和運動性下降。但研究結果有待在更大群體的進一步驗證。另一項全基因組mtDNA單核苷酸多態性分析顯示，MT-ND4基因突變m.11696G>A與精子活力降低有關，證明m.11696G>A突變增加AZS的風險[29]。目前關于單核苷酸點突變影響精子發生和精子活力的機制尚未闡明，推測mtDNA點突變可能通過降低線粒體呼吸鏈復合物的活性而導致精子功能障礙[29]。

3 miRNA調控異常

MiRNA是一類內源性具有調控功能的非編碼RNA，長約20～25個核苷酸，可以調控大概60%蛋白質編碼基因。MiRNA在多種生物過程中發揮重要作用，包括胚胎發生，細胞分化，器官發生，代謝和凋亡[30]。精子發生是一個復雜、高度組織的過程，其中轉錄后miRNA調控是必不可少的過程[31]。然而目前僅有少許文獻報道了miRNA參與AZS調控。

精子miRNA表達譜分析發現AZS精子microRNA表達失調。與正常精子對比，AZS患者有50種miRNA表達上調，27種miRNA表達下調，其中miR-34b、miR-122、and miR-1973表達差異最大[32]。既往的研究表明miR-122在圓形精子細胞中通過靶向特定mRNA參與轉錄蛋白2(transition protein 2，TNP2)的轉錄后調節[33]，表明miR-122在睪丸發育或精子發生過程中起著重要的作用。miR-151a-5p是一種線粒體相關的miRNA[34]，既往多被認為參與腫瘤形成、肝臟和心臟損失過程。ZHOU等[34]研究發現AZS患者miR-151a-5p顯著增加，并通過將miR-151a-5p轉染至GC-2細胞系，發現miR-151a-5p通過下調細胞色素B表達，抑制線粒體電子傳遞鏈活性，減少ATP生成，導致精子細胞運動性減少。該研究首次系統性證明線粒體相關miRNA在AZS中的作用，揭示了miR-151a-5p通過調節CYTB水平導致AZS的分子機制，同時也為AZS治療提供潛在靶點。糖酵解已被證明是哺乳動物精子鞭毛產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的重要途徑。let-7 miRNA家族參與了多種細胞過程和疾病發病機制的調節。let-7b-5p通過調節AURKB在細胞分裂過程中維持保真度。然而，關于let-7b-5p在生殖系統中的功能知之甚少。ZHOU等[35]分析糖酵解相關miRNA發現，與健康對照者相比，在重度AZS患者中僅發現1種精漿miRNA let-7b-5p顯著降低，并且通過敲掉miRNA let-7b-5p證實糖酵解活性降低。該研究表明miRNA let-7b-5p表達下調可以通過參與抑制糖酵解，減少鞭毛生成ATP，降低精子運動力。線粒體和糖酵解都是精子運動的能量來源，相關調控miRNA表達失調容易引起能量崩潰及精子運動下降。

正常情況下，精子活力是在附睪中獲得的，miRNA參與調節附睪微環境，為精子獲得活力提供基礎[36]。QING等[37]發現AZS患者中五種附睪miRNA(miR-891b，miR-892b，miR-892a，miR-888和miR-890)表達失調，表明miRNA群表達失調很可能是AZS的一種表觀遺傳基礎。既往研究發現miR-34家族是精子發生所必需的[38]。LI等[39]研究發現miR-34c-3p和PLCXD3(phospholipase C X-domain containing 3)基因是一對miRNA-靶基因，PLCXD3位于睪丸生殖細胞內，在少AZS患者中低表達，miR-34c-3p能夠降低PLCXD3表達，能夠作為特發性少精癥的標志物；同時該研究還發現未曾報道的miR-411-5p，miR-375，miR-410和miR-758在精子生成中發揮關鍵作用，但作用及機制有待進一步闡明。YANG等[40]發現隱睪患者睪丸組織中miR-34c明顯降低，Nanos2蛋白質水平在小鼠模型中顯著上調，miR-34c/Nanos2的異常表達破壞了精原干細胞自我更新和分化之間的平衡，最終破壞了隱睪睪丸的精子發生，該項研究為隱睪癥引起的男性不育機制提供了新的見解。此外，據報道miR-27a、miR-629-3p也是精子活力的調控因子，表達失調可導致嚴重AZS[41-42]。目前的研究已經表明miRNA參與AZS的調控，但尚未發現AZS的特異性miRNA，有望進一步研究發現AZS特異性miRNA，為AZS的診斷和治療提供新型生物標記物。

4 精子端粒長度改變

端粒包含非編碼串聯重復序列，可以保護染色體免受末端侵蝕，而不會導致遺傳信息丟失。在生殖細胞中，端粒長度得以保留，表明端粒在維持人類配子發生和生育中的重要作用。研究發現精子端粒長度(sperm telomere length，STL)與精子質量顯著相關[43]。STL與精子運動力和精子活力呈正相關，與精子DNA片段化呈負相關，可以作為衡量精子質量的標記物[43]；還有研究報道STL與精子活性氧含量之間呈負相關，STL縮短會導致精子ROS增多，降低精子質量；大量文獻報道STL與精子數量存在線性關系，少精子癥患者的STL比正常精子更短[43-45]。目前尚不清楚STL影響精子質量的機制，部分學者認為端粒可能發生分離錯誤，功能失調的短端粒誘導精子DNA斷裂[46]，引起生殖細胞凋亡阻礙精子發生，生殖細胞中較短的端粒可能被認為是生精障礙和男性不育的一個新的推定原因；另一方面，端粒長度縮短可能是精子受損的標志，即端粒長度縮短可被視為后果，而不是精子發生改變的原因。然而，一些研究得出了截然不同的結論，認為STL與精子質量[47-48]、DNA片段化[47-49]、活性氧含量[48]無關，應慎重考慮把CTL作為衡量精子質量和男性不育的標記物。最近一項研究[50]通過比較分析STL與精液質量的關系及對預測輔助生殖的效果，認為端粒在人類生殖中起關鍵重要作用，強烈建議把STL作為男性不育的生物標志物。目前關于精子端粒長度在精子質量和男性不育方面的作用及機制尚無定論，有待進一步研究闡明。

5 總結與展望

AZS是男性不育的主要原因之一。精子的發生和運動是由眾多基因共同協調的。近年來，關于精子發生和精子運動缺陷的基礎研究已經取得了突破，目前的研究已經發現某些基因突變、miRNA表達失調、線粒體及鞭毛功能障礙參與AZS發生發展。然而，目前的研究多僅局限于單個基因改變引起的精子運動障礙，未來需要系統性的生物學研究，包括全方位考慮基因組學，轉錄組學，蛋白質組學，代謝組學和表觀遺傳學改變，進一步闡明AZS的病理生理學基礎，為AZS診斷和治療提供新的靶點。