類固醇受體輔助活化因子-1在膠質母細胞瘤中的表達 及其對上皮間質轉化的作用探討

趙鈞鋒，李翔宇，王 迅

（大連市第三人民醫院神經介入中心，遼寧 大連 116033）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見的侵襲性腦腫瘤，預后極差，也被世界衛生組織歸類為星形細胞系的Ⅳ級膠質瘤。目前標準的治療方案包括手術、替莫唑胺（TMZ）化療及與放療聯合治療等，但治療效果不甚理想[1]。研究表明，GBM患者初診后的中位生存期僅為15～18個月，預后不良與GBM細胞的致瘤屬性和膠質母細胞瘤干細胞（GSCs）有關[2]。GSCs具有自我更新和多重分化能力，對化療和放療具有耐藥性。因此，它們可能是GBM治療失敗和高復發率的原因。研究表明GSCs 能夠促進GBM的發生、發展，且與GBM的上皮間質轉化（EMT）、遷移侵襲、放化療耐受性及復發緊密相關[3]。而EMT的活化進程與腫瘤干細胞的干性激活及活性調節方面又具有緊密的聯系。

類固醇受體輔助活化因子-1（SRC-1）是一種重要的核受體轉錄活性調節因子，是SRC家族中在腦組織中分布最多的成員[4]。SRC-1可參與調節多種機體的正常生理功能，而且SRC-1可作為核受體共活化因子或獨立的因子促進多種癌癥的發生發展[5]，但SRC-1在GBM中的作用及機制尚未明確。本研究的前期研究首次發現：SRC-1表達與膠質瘤惡性等級呈正相關；而且在GBM細胞中敲低或過表達SRC-1后，發現SRC-1可促進細胞增殖、遷移，降低對放化療的敏感性，增加細胞自我更新能力。故本研究將在細胞模型中進一步明確SRC-1在GBM中的表達，并統計分析SRC-1表達與EMT、腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲的相關性，為尋找潛在的治療靶點及建立新的有效的治療方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取人腦膠質細胞株LN229、U251、U87-MG、T98G、U118和SVG-p12作為本研究細胞模型。所有細胞在添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基中進行培養，保濕環境溫度37 ℃，在含5% CO2大氣中。

1.2 研究方法①構建SRC-1敲低的細胞株。利用shRNA干擾技術，將SRC-1-shRNA、control-shRNA及Luciferase cDNA構建至PLKO.1慢病毒載體，得到PLKO.1-S RC-1-shRNA-luc及PLKO.1-control-shRNA-luc質粒；在293T細胞中進行病毒包裝及富集，將收集的病毒上清感染U251細胞，通過實時聚合酶鏈反應（Realtime PCR）和蛋白質印跡法（Western blot）檢測SRC-1表達情況，得到SRC-1敲低的U251-SRC-1-luc shRNA及U251-control-luc shRNA細胞。②構建SRC-1過表達的細胞株。利用cDNA轉染技術，以pENTER-NCOA1（SRC-1）（購自吉凱基因）質粒為模板，PCR擴增合成SRC-1 cDNA。將SRC-1 cDNA及Luciferase cDNA構建至pCDH-CMV-MCS1-EF1-Puro病毒載體，得到pCDHSRC1-luc質粒；病毒上清分別感染SVG p12和LN229細胞，Real-time PCR及Western blot檢測SRC-1表達情況，最終獲得SVG p12-SRC-1-luc、SVG p12-control-luc及LN229-SRC-1-luc、LN229-control-luc。

1.3 觀察指標①免疫染色、Real-time PCR和Western blot法檢測各細胞中SRC-1表達情況。②提取細胞的RNA和蛋白，分別采用Real-time PCR和Western blot檢測各細胞中鈣黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Twist相關蛋白1（Twist1）等EMT相關基因的表達，分析表達差異。③選取TMZ和索拉菲尼（SOR）兩種膠質母細胞瘤臨床用藥聯合SRC-1敲低進行四唑鹽（MTT）比色法實驗，48 h檢測增殖能力，觀察SRC-1敲低對膠質瘤母細胞化學治療敏感性的影響。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據。計量資料以()表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組及以上數據間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRC-1和Twist1在細胞模型中表達情況采用RTPCR方法檢測各細胞株及對照細胞中SRC-1 mRNA的表達。SRC-1在腫瘤與正常細胞比較時log2轉化mRNA表達倍數的變化見圖1A。SRC-1的平均mRNA表達log2 (T/N)比為0.58。SRC-1細胞中明顯上調。Western blot進一步驗證了SRC-1的上調，見圖1B。SRC-1蛋白在腫瘤細胞中明顯過表達。此外，腫瘤細胞中SRC-1的免疫組化染色顯示，SRC-1也有高表達，見圖1C。在數種細胞系中檢測了SRC-1的蛋白表達，發現SRC-1在U251和U87MG中高表達，在T98MG、LN229及SVG p12中低表達，見圖1D。

圖1 SRC-1和Twist1在細胞模型中表達情況

2.2 SRC-1的表達對膠質細胞遷移、侵襲和腫瘤移植生長的影響為了確定SRC-1在GBM的作用，本研究使用慢病毒的shRNA表達系統抑制細胞系中SRC-1的表達，SRC-1蛋白表達被sh-SRC-1顯著下調（t=38.347，P＜0.05）；下調SRC-1抑制了Twist1蛋白的表達（P＜0.05）。此外，敲低SRC-1可增加E-cadherin的表達（t=33.881，P＜0.05），抑制Vimentin的表達（t=34.119，P＜0.05），見圖2。

圖2 SRC-1的表達對膠質細胞遷移、侵襲和腫瘤移植生長的影響

2.3 SRC-1敲低對膠質瘤母細胞化學治療敏感性的影響選取TMZ和SOR兩種膠質母細胞瘤臨床用藥聯合SRC-1敲低進行四唑鹽(MTT)比色法實驗，48 h檢測增殖能力，見圖3。與獨加藥組比較，SRC-1敲低后在500 μmol/L和1 000 μmol/L濃度的TMZ時都能更好地抑制U251細胞增殖（t=18.945，P＜0.05；t=26.127，P＜0.05），50 μmol/L和80 μmol/L濃度的SOR得出相似的結果（t=21.335，P＜0.05；t=24.882，P＜0.05），表明敲低SRC-1能增強膠質母細胞瘤細胞對臨床藥物TMZ和SOR的敏感性。

圖3 SRC-1敲低對膠質瘤母細胞化學治療敏感性的影響

3 討論

GBM是惡性程度最高的腦膠質瘤（WHO，Ⅳ級，2007），確診后5年生存率小于5%[6]。GBM的重要生物學特征是侵襲性生長，易復發和腫瘤組織內部細胞異質性。目前臨床上仍以手術結合放化療為主要治療方法，因其增長迅速、高度侵襲性及放化療多耐性等特點，預后極差，中位生存期僅15個月[7]。

EMT是上皮細胞失去極性與上皮樣組織，轉化成間葉細胞表型的過程。而在此進程中上皮細胞可以轉化成間質細胞，并再次轉化為上皮細胞，這是腫瘤干細胞可塑性的主要表現，發生EMT的腫瘤細胞具有干樣的特征[8]。EMT的活化與腫瘤干細胞的干性激活及活性調節方面具有緊密的聯系。因此，EMT是癌癥進展的關鍵，其特點是腫瘤細胞中E-cadherin表達減少，Vimentin表達增加[9]。

SRC-1可參與調節多種機體的正常生理功能，如腦的發育與成熟、血管生成、機體代謝及生殖等。SRC-1在多種病理過程中也起重要作用，如肥胖、糖尿病、血脂異常、癌癥等[10]。課題組前期采用組織芯片及免疫組織化學的方法檢測發現：SRC-1的表達與人膠質瘤分級呈正相關，在GBM中表達最高；而且通過穩定敲低SRC-1可導致GBM細胞自我更新能力、干性相關基因蛋白的表達下降，而過表達SRC-1則增強GBM的干性表達。由此提示SRC-1與GBM的發生發展及激活GSCs方面發揮重要作用。既往研究證實在乳腺癌中，SRC-1可間接抑制E-cadherin的表達[11]。本研究中發現SRC-1在膠質瘤中高表達，且與惡性分級呈正相關，在人GBM細胞U251和LN229中，分別敲低和過表達SRC-1研究其在GBM中的作用發現：SRC-1可促進腫瘤細胞的增殖；增強細胞遷移與侵襲能力，抑制膠質母細胞瘤細胞系中E- cadherin的表達，增加Vimentin的表達。因此，推測SRC-1通過誘導EMT促進膠質母細胞瘤細胞的遷移和侵襲。

TMZ和SOR作為目前臨床上用于治療GBM的主要化療藥物，對GSCs的敏感性低于GBM腫瘤細胞，這與DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（MGMT）的表達增加有關[12]。此外，其他化療藥物，如卡鉑、紫杉醇和依托泊苷等，對GSCs的敏感性也下降[13]。本研究結果顯示SRC-1的下調顯著增強膠質母細胞瘤細胞對臨床藥物TMZ和SOR的敏感性，也與SRC-1可導致GBM細胞自我更新能力和干性相關基因蛋白的表達下降有關[14]。

綜上所述，SRC-1在體外可促進膠質母細胞瘤細胞的非錨定生長、細胞遷移和侵襲，與誘導EMT過程有關。SRC-1是膠質母細胞瘤患者潛在的預后生物學標記物和治療靶點。