熒光染色法在淺部真菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用

齊寶全　車付彬　王麗娜

[摘要] 目的 觀察熒光染色法在淺部真菌檢測(cè)中的應(yīng)用效果，尋找一種高效、快速的淺部真菌檢驗(yàn)方法。 方法 對(duì)169例2017年9月～2018年12月聯(lián)勤保障部隊(duì)北戴河康復(fù)療養(yǎng)中心門診臨床擬診為淺部真菌感染的患者標(biāo)本先用熒光染色法檢驗(yàn)，然后稍微加熱后換用10%KOH法進(jìn)行檢測(cè)，觀察熒光染色法和10%KOH濕片法兩種方法總的真菌檢測(cè)陽性率以及對(duì)手足癬、體股癬及花斑糠疹、甲癬（指甲、趾甲）不同感染部位真菌檢測(cè)的陽性率。 結(jié)果 熒光染色法真菌總的檢出率為87.6%，普通10%KOH濕片法真菌總的檢出率為59.8%，兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;手足癬、體股癬及花斑糠疹、甲癬（指甲、趾甲）熒光染色法真菌陽性率分別是81.7%、94.6%、82.9%，而10%KOH濕片法真菌陽性率分別是46.7%、77.0%、45.7%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 熒光染色法真菌檢測(cè)技術(shù)是一種敏感性高、快捷、可靠的淺部真菌檢驗(yàn)方法，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 熒光染色法;KOH濕片法;真菌直接鏡檢;真菌感染

[中圖分類號(hào)] R756? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）34-0090-03

Application of fluorescent staining in the detection of superficial fungi

Qi Baoquan? ?CHE Fubin? ?WANG Lina

Department of Dermatology， Beidaihe Rehabilitation Center， Joint Service Support Force of People's Liberation Army， Qinhuangdao? ?066100， China

[Abstract] Objective To observe the application effect of fluorescent staining in the detection of superficial fungi， and to find an efficient and rapid method for the detection of superficial fungi. Methods A total of 169 patients who were diagnosed as superficial fungal infections in the outpatient clinic of Beidaihe Rehabilitation Center of the Joint Service Support Force from September 2017 to December 2018 were first tested by fluorescence staining and then heated slightly and replaced with 10%KOH. The positive rate of total fungal detection and the positive rates of fungal detection in different infection sites of tinea manuum and pedis， tinea corporis and cruris and pityriasis versicolor， tinea unguium（fingernails and toenails） were observed. Results The total detection rate of fungi by fluorescent staining was 87.6%. The total detection rate of common 10%KOH wet slide method was 59.8%. There was no significant difference between two methods（P<0.01）. The positive rates of fungal infections of tinea manuum and pedis， tinea corporis and cruris and pityriasis versicolor， tinea unguium（fingernails and toenails） were 81.7%， 94.6%， and 82.9%， respectively， while the positive rates of 10%KOH wet slide method were 46.7%， 77.0%， and 45.7%， respectively. The difference between the two groups was also statistically significant（P<0.01）. Conclusion Fluorescence staining fungal detection technology is a sensitive， fast and reliable method for detecting superficial fungi， which is worthy of promotion.

[Key words] Fluorescent staining; KOH wet slide method; Direct microscopic examination of fungi;Fungal infection

淺部真菌感染是皮膚科常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響人民健康，及時(shí)正確地治療該類疾病有賴于正確的診斷，真菌直接鏡檢是淺部真菌病診斷的重要輔助檢查，10%KOH濕片法是一種常用的真菌鏡檢方法，雖然該方法簡(jiǎn)單，但存在視野模糊、檢出率偏低的缺點(diǎn)，特別是甲癬檢出率更低，因而易造成誤診、誤治。尋找一種快捷、高效的真菌檢測(cè)技術(shù)是皮膚科醫(yī)師的迫切需求。近年來真菌熒光染色法逐漸應(yīng)用于臨床并受到一致好評(píng)。我院自2017年9月應(yīng)用熒光染色法進(jìn)行淺部真菌檢測(cè)，取得滿意效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月～2018年12月我院門診高度擬診淺部真菌感染患者169例為研究對(duì)象，其中皮屑標(biāo)本包括手足癬60例、體股癬63例、花斑糠疹11例，甲屑標(biāo)本共35例。

1.2 方法

1.2.1 熒光染色檢測(cè)法? 患者皮損處75%乙醇消毒后用鈍刀刮取皮屑或甲屑，置于載玻片上，滴一滴熒光染色液（立特晰，江蘇諾鬲生物科技有限公司生產(chǎn)，主要組分包括10%KOH溶液、熒光素，純水），蓋上蓋玻片，輕輕加壓，用濾紙或棉簽吸凈溢出的多余染色液，持續(xù)染色1 min，置于熒光顯微鏡（萊卡DM500）下觀察結(jié)果，看到熒光標(biāo)記的菌絲或孢子即判定為陽性[1]，記錄并拍照。

1.2.2 普通10%KOH濕片檢測(cè)法? 熒光染色檢測(cè)完畢后，同一標(biāo)本間隔5 min之后稍微加熱待角質(zhì)充分溶解后再將該標(biāo)本在普通光學(xué)顯微鏡（萊卡DM500）下觀察結(jié)果，看到菌絲或孢子即判定為陽性，記錄并拍照（因?yàn)闊晒馊旧褐泻?0%KOH，所以在普通光學(xué)顯微鏡下檢查就等同于普通10%KOH濕片法，熒光素只有在熒光顯微鏡下才顯色，而在普通顯微鏡下不顯示任何顏色，所以不會(huì)對(duì)10%KOH濕片法結(jié)果產(chǎn)生影響）。為防止主觀性偏差，此步驟換成另外一名醫(yī)師進(jìn)行操作。此鏡檢過程中保持與熒光染色法放大倍數(shù)一致。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)60例手足癬、74例體股癬和花斑糠疹、35例甲癬（指甲、趾甲）分別用熒光染色法和10%KOH濕片法進(jìn)行真菌檢測(cè)，觀察兩種方法對(duì)不同感染部位的真菌檢測(cè)陽性率及兩種方法總的真菌陽性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用軟件SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法鏡下檢測(cè)效果

熒光染色法鏡下可觀察到真菌輪廓呈亮藍(lán)色，可看到明顯的菌絲，菌絲與周圍背景形成強(qiáng)烈反差，易于識(shí)別。普通10%KOH濕片法背景雜亂、昏暗，反差小，真菌結(jié)構(gòu)不清楚，與雜質(zhì)不易識(shí)別。兩種方法檢測(cè)效果見封三圖5、圖6。

2.2 兩種方法真菌檢測(cè)陽性率

手足癬、體股癬及花斑糠疹、甲癬（指甲、趾甲）熒光染色法真菌陽性率分別是81.7%、94.6%、82.9%，而10 %KOH濕片法真菌陽性率分別是46.7%、77.0%、45.7%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。熒光染色法和10%KOH濕片法總的真菌陽性率分別為87.6%和59.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

體股癬、手癬、甲癬、花斑糠疹等淺部真菌感染性皮膚病是皮膚科常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響人民健康，這類疾病的診斷有賴于真菌的檢查。常用的真菌檢驗(yàn)方法有培養(yǎng)法、真菌DNA檢測(cè)法、直接鏡檢法。培養(yǎng)法雖然被認(rèn)為是最可靠的真菌檢測(cè)法，但耗時(shí)（至少需2周才能判定結(jié)果）而且需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，對(duì)實(shí)驗(yàn)員的技術(shù)要求較高，基層醫(yī)院難以開展。真菌DNA檢測(cè)法需要特殊的檢驗(yàn)設(shè)備和較高的實(shí)驗(yàn)室條件要求，多數(shù)基層醫(yī)院無法開展。真菌直接鏡檢法長(zhǎng)期以來都是淺部真菌感染性皮膚病輔助檢查的常用手段，是實(shí)驗(yàn)室診斷真菌感染的首要步驟，也是最快速、性價(jià)比最具優(yōu)勢(shì)的診斷手段[2]，這當(dāng)中普通KOH濕片法開展最普遍，該方法設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，操作技術(shù)容易掌握，但KOH法需要加熱，角質(zhì)溶解效率低下，鏡下真菌與皮屑、雜質(zhì)等顏色一致，背景雜亂，不易辨認(rèn)，對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)、經(jīng)驗(yàn)依賴較高，易導(dǎo)致假陰性，特別是對(duì)于甲真菌病的檢出率很低，常造成臨床誤診誤治。

近年來逐漸興起的熒光染色直接鏡檢法顯示出極大優(yōu)勢(shì)。熒光染色法通過熒光素標(biāo)記物與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)和葡聚糖共價(jià)結(jié)合[3-4]，形成熒光復(fù)合物，而角蛋白、脂質(zhì)等不著色，在熒光顯微鏡特定的激發(fā)光波段（340～400 nm）照射下，菌絲或孢子能發(fā)出亮藍(lán)色熒光，與背景形成強(qiáng)烈反差，真菌形態(tài)清晰可見，可觀察到孢子的形態(tài)和菌絲的典型橫隔結(jié)構(gòu)，極大提高了檢出率，適用于目前發(fā)現(xiàn)的各種致病真菌的直接涂片檢查。基于鏡下真菌形態(tài)特征，還可以進(jìn)一步對(duì)致病真菌種類進(jìn)行提示性診斷，更具臨床價(jià)值[5]。該檢驗(yàn)法為一步操作法，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、快速，反應(yīng)時(shí)間只需數(shù)十秒鐘即可完成，檢驗(yàn)者不需要更多經(jīng)驗(yàn)就能輕松掌握。

本研究提示手足癬、體股癬及花斑糠疹、甲癬（指甲、趾甲）的真菌檢出率以及總的真菌檢出率，熒光染色法都明顯高于10%KOH濕片法，極大減少了誤診率。既往杜鵬等[6]研究熒光染色法和10%KOH濕片法總的真菌陽性率分別是90.6%和67.4%，徐艷等[7]研究結(jié)果則分別是80.95%和55.23%，本研究結(jié)果與上述結(jié)果相接近。其他學(xué)者研究結(jié)果雖然不完全相同，但本研究與其結(jié)論一致[8-14]，熒光染色法總的真菌陽性率和不同感染部位真菌陽性率均高于10%KOH濕片法。值得注意的是，熒光染色法對(duì)植物纖維素也可標(biāo)記，玻片上、標(biāo)本中可能存在少量植物纖維，可能被熒光素標(biāo)記，但纖維形態(tài)不具備規(guī)則性，大小、粗細(xì)、亮度也不同，沒有菌絲的分支管狀結(jié)構(gòu)，容易與真菌區(qū)分[15]。此外，熒光檢測(cè)法需要特殊顯微鏡，收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)高于普通KOH濕片法。

綜上所述，熒光染色真菌檢驗(yàn)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、高效、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣。

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（收稿日期：2019-10-28）