康萊特注射液對人下咽鱗狀癌細胞裸鼠移植瘤放療敏感性影響及其機制研究

王釔力　黃莉　許明君　衷敬華　廖家華　袁軍

[摘要] 目的 研究康萊特注射液對人下咽鱗狀癌細胞（FADU）裸鼠移植瘤的放射增敏作用，并探討其對腫瘤微血管生成的影響及機制。 方法 采用皮下注射法對裸鼠建立鱗狀癌細胞荷瘤模型，并根據實驗目的的不同隨機分為對照組、單純放射治療組、單純藥物（康萊特注射液）治療組及聯合（放射+康萊特注射液藥物治療）組。通過測量各組裸鼠腫瘤的體積并繪制生長曲線，計算抑瘤率;采用免疫熒光檢測移植瘤中CD31的表達情況并進行計數微血管密度（NVD）;提取腫瘤組織總蛋白，實時定量PCR和Western blot分別檢測移植瘤組織中Periostin和VEGF-C的mRNA和蛋白表達。 結果 與單獨藥物治療及單純放療相比，聯合治療組腫瘤體積顯著減少（P<0.05），此時其聯合指數（CI=0.83）。免疫熒光結果顯示聯合治療組也能顯著減少微血管密度，與對照組、單純藥物組和放療組比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。此外，雖然放療和康萊特注射液單獨處理也能降低移植瘤組織中Periostin和VEGF-C的mRNA和蛋白表達，但兩者聯合后其mRNA和蛋白表達水平進一步減少。 結論 康萊特注射液可增強FADU細胞裸鼠移植瘤對放療的敏感性，其機制可能與影響Periostin和VEGF-C的表達有關。

[關鍵詞] 喉咽腫瘤;康萊特注射液;放射增敏;人下咽鱗狀癌細胞

[中圖分類號] R739.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）34-0035-04

Effect of Kanglaite injection on radiosensitivity of human hypopharyngeal squamous cell carcinoma xenografts in nude mice and its mechanism study

WANG Yili HUANG Li XU Mingjun ZHONG Jinghua LIAO Jiahua YUAN Jun

Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the radiosensitivity effect of Kanglaite injection on human hypopharyngeal squamous cell carcinoma（FADU） xenografts in nude mice， and to explore its effect on tumor microangiogenesis and its mechanism. Methods Nude mice were established into a squamous cell carcinoma tumor-bearing model by subcutaneous injection. They were randomly divided into control group， radiotherapy group， drug （Kanglaite injection） treatment group and combination （radiation+ Kanglaite injection drug treatment） group. The tumor inhibition rate was calculated by measuring the volume of tumor in each group and drawing the growth curve. The expression of CD31 in the xenografts was detected by immunofluorescence and the microvessel density （NVD） was counted. Then the total protein of the tumor tissue was extracted. The mRNA and protein expression of Periostin and VEGF-C in transplanted tumor tissues was detected by real-time quantitative PCR and Western blot respectively. Results Compared with that of radiotherapy group and drug treatment group， tumor volume was significantly reduced in the combination group（P<0.05）， and at the same time the combined index （CI） was 0.83. Immunofluorescence results showed that the combined treatment group also significantly reduced microvessel density， and the difference was statistically significant compared with that of the control group， the drug group and the radiotherapy group （P<0.05）. In addition， although radiotherapy and Kanglaite injection alone could reduce the mRNA and protein expression of Periostin and VEGF-C in xenografts， the combination of the two further reduced the mRNA and protein expression levels. Conclusion Kanglaite injection can enhance the sensitivity of FADU cell carcinoma xenografts in nude mice to radiotherapy， and its mechanism may be related to the influence of Periostin and VEGF-C expression.

[Key words] Laryngeal neoplasms; Kanglaite injection; Radiosensitization; Human hypopharyngeal squamous cell carcinoma

近年來下咽癌的治療盡管使用了綜合治療模式，但總體5年生存率并沒有得到提高，難以預測和控制的復發及轉移是導致下咽癌患者死亡率居高不下的主要原因。因此，探索有效的治療方法成為下咽癌治療的主要研究課題。對于晚期下咽癌患者，手術切除腫瘤的同時，能否保留喉功能成為提高患者生活質量的重要決定因素[1，2]。術前放療或者誘導化療，使腫瘤的原發面積減小，從而為喉功能的保留提供可能。我國傳統中醫藥在抗腫瘤方面有其特殊功效，康萊特注射液是從薏苡仁中提取的一種抗腫瘤制劑，具有誘導細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞有絲分裂及提高免疫功能的作用，同時可減輕放、化療的毒副作用[3，4]。但其在聯合放療治療下咽癌中的作用目前尚不完全明確，本研究擬建立人下鱗狀癌細胞裸鼠移植瘤模型，觀察康萊特注射液對放療是否具有協同效應，并初步探討其作用機制，從而為臨床應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人下咽癌細胞株FADU（美國ATCC）。康萊特注射液（浙江康萊特藥業有限公司，規格：100 mL：10 g，國藥準字Z10970091））。DMEM培養基、胰蛋白酶及胎牛血清（美國Invitrogen）。CD31抗體（Santa Cruz），AlexaFluor 594抗體（Life），P-ERK1/2、total ERK1/2、P-Akt和total Akt單克隆抗體（Cell Signaling），β-actin、Periostin Periostin和VEGF-C多克隆抗體（Santa Cruz）。

1.2 細胞培養與移植瘤模型的建立

人下咽癌細胞株FADU用含有10%胎牛血清和抗生素的DMEM培養基（Gibco）培養于37℃、5% CO2培養箱中。FADU細胞每24～48 h傳代1次，獲取生長旺盛的細胞充分吹打至單細胞懸液，調整其密度為2×107/mL后，獲取0.2 mL細胞注射于BALC/c裸鼠皮下建立裸鼠移植瘤模型。

1.3 實驗分組與處理

60只裸鼠根據實驗目的不同，隨機分為空白對照組（6只，等體積生理鹽水注射）、單純放射治療組18只、單純康萊特注射液組（12.5 mL/kg）18只及放射+康萊特注射液組18只。放射治療組給予總劑量為12 Gy的X線照射，劑量為300 cGy/min。其中在研究康萊特與放射治療的協同效應時，分別給予裸鼠不同劑量的康萊特注射液和放射劑量組合（康萊特/放射劑量固定比為1.04）處理。獲得移植瘤生長抑制率為50%左右的劑量組合[此時總劑量為12 Gy的X線照射，劑量為300 cGy/min]用于下一步研究。

1.4 裸鼠移植瘤生長曲線的繪制及腫抑率測定

各組小鼠每隔72 h測定腫瘤體積。并根據腫瘤體積的大小繪制生長曲線，并參考文獻提供的方法計算藥物的聯合系數[5]。14 d治療結束后，麻醉處死小鼠，4%多聚甲醛心臟灌注，并獲取腫瘤組織，包埋后制成5 μm冰凍切片用于免疫熒光分析。

1.5 免疫熒光及微血管計數

冰凍切片經5%山羊血清室溫封閉30 min。后滴加CD31抗體室溫孵育2 h，PBS漂洗3次后，吸水紙吸干多余液體后，滴加稀釋好的AlexaFluor 594標記的二抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次，每次3 min。滴加DAPI染色液避光孵育15 min，PBS洗滌多余的DAPI，共洗滌3次。用吸水紙吸干殘留液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察，并行微血管計數。

1.6 實時定量PCR檢測mRNA表達

實時定量PCR測定Periostin和VEGF-C mRNA的水平。首先GE公司提供的試劑盒提取組織總RNA，隨后獲取1 μg RNA將其逆轉錄為cDNA。使用Primer Express軟件設計Periostin和VEGF-C基因的引物。人Periostin：正向引物：5'-GCACCGAGTAATGAGGCTTG-3';反向引物：5'-TGCTCTCCA AACCTC TAC GG-3';VEGF-C：正向引物：5'- CATTGGAGCCTTGCCTTG -3';反向引物：5'-TTCGTGGGGTTTCTGGTCT-3'。產物長度分別為242bp和245bp。在實時定量PCR儀（Chromo4，Bio-Rad）上進行PCR。25 μL PCR反應含有30 ng cDNA和200 nmol/L引物。條件為：95℃ 5 min，隨后進入40個循環：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s。采用比較閾值循環（CT）方法，通過計算其與管家基因GAPDH的比值來確定相對基因表達水平。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

將組織制備成勻漿，用裂解緩沖液在4°C下裂解60 min以提取總蛋白。將蛋白質樣品（35 μg）經12%SDS-PAGE處理后，電轉至硝酸纖維素膜（Amersham，MA，USA）上，經封閉后，分別用P-ERK1/2，total-ERK1/2，total-Akt，P-AKT，Periostin和VEGF-C抗體4℃孵育過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育30 min。最后經化學發光、顯影，并用Image J（National Institute of Health，Bethesda，MD，USA）軟件進行灰度掃描。

1.8 統計學分析

所有數據均使用SPSS軟件進行分析（SPSS17.0）進行。計量資料用均數±標準差（x±s）表示。所有實驗至少進行3次。采用方差分析后，再采用t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度康萊特及放射劑量對移植瘤體積的影響

60只裸鼠在接種FADU細胞10 d后均形成結節，全部成瘤，且在康萊特注射液和（或）放療之前其移植瘤體積比較，差異無統計學意義（P>0.05）;隨著康萊特濃度/放療劑量的增加，對移植瘤的生長也有所不同，通過計算兩者的聯合指數CI后顯示，（2.08～14.58）mL/kg康萊特和2～14 Gy放射劑量對移植瘤的生長增殖具有協同作用（CI<1）。在隨后的研究中，本實驗選擇了12.5 mL/kg和12 Gy放射劑量作為聯合組（此時移植瘤生長抑制率為50.1%）。見圖1。

2.2 不同濃度康萊特及放射劑量對新生血管形成的影響

對照組CD31表達水平較高，單純康萊特注射液以及放療組CD31的表達水平有所降低，而兩者聯合使用后CD31表達進一步減少。通過對區域血管計數并計算MVD值后結果顯示，康萊特組（27.5±3.4）和放療組（24.2±4.1）與對照組（54.6±8.1）之間MVD比較，差異有統計學意義（P<0.05），而聯合組MVD（18.5±2.7）低于康萊特和放療組（P<0.05）。

2.3 康萊特注射液聯合放療對ERK1/2和Akt磷酸化的影響

Western blot結果顯示，對照組中ERK1/2磷酸化水平較高，經康萊特治療后ERK1/2磷酸化水平有所減弱，放療組也與之類似。同樣，Akt磷酸化的變化趨勢與ERK1/2一致。見表1、圖3。

2.4 康萊特注射液聯合放療對Periostin和VEGF-C表達的影響

實時定量PCR結果顯示，對照組Periostin和VEGF-C mRNA呈高水平表達，康萊特Periostin和VEGF-C mRNA分別降低了17%和21%。放療組與對照組比較，兩者分別降低了28%和36%。而兩者聯合后，表達水平降低了37%和46%。Periostin和VEGF-C的蛋白表達趨勢與mRNA類似。見表2、圖4。

3 討論

下咽癌年發病率為（0.2～0.8）/10萬，占頭頸部惡性腫瘤的1.4%～5.0%。其解剖位置較深，早期發現和早期診斷困難，出現臨床表現或就診時多已是局部進展期。下咽癌細胞分化程度較低，幾乎均為中、低分化鱗狀細胞癌，惡性程度高，較早出現頸部淋巴結轉移，常浸潤喉、口、咽、頸段食管和咽旁間隙等部位。康萊特注射液主要成分是從薏苡仁中提取的薏苡油，是抗腫瘤制劑，具有誘導腫瘤細胞凋亡，阻滯腫瘤細胞有絲分裂，殺傷癌細胞及提高免疫功能的作用，同時可減輕放療、化療的毒副作用，是目前臨床用于肺癌的中藥制劑之一。大量基礎和臨床研究證明，康萊特注射液具有抗腫瘤、化療增敏、減輕副反應、增強機體免疫功能，提高生活質量等作用[6]。Lu等[7]利用肝癌細胞株HepG2研究發現康萊特可影響細胞的G2/M期而抑制腫瘤細胞有絲分裂，同時通過Fas途徑誘導腫瘤細胞凋亡。此外，康萊特能降低VEGF表達及血管內皮細胞膜上VEGFR-2蛋白表達和抑制EGFR蛋白的表達。康萊特對肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤有明顯治療效果，提高患者生存質量，與其他藥物聯合放療更具優勢。目前康萊特在下咽癌中的作用未見報道，希望通過本研究能為提高下咽癌治療有效率并減低毒副作用，提供新的證據。在本實驗中，本文對康萊特的體內放療增敏效果進行研究。為了研究康萊特對放療是否具有協同作用，本文主要研究兩者聯合使用前后對細胞生物學行為的改變。Isobologram分析是一種得到廣泛應用的研究藥物是否具有協同作用的方法，其原理是將固定比例聯合應用的藥物劑量與產生同樣效應的各組成藥物劑量進行比較，根據單獨用藥所獲得量效曲線，計算出各藥物的IC50，然后用同樣的方法獲得藥物聯合應用時的IC50并計算兩種藥物的聯合指數。若聯合指數<1，表明兩種藥物具有協同作用[8]。本研究發現康萊特與放療聯合應用后，腫瘤體積與單純放療組或康萊特組相比差異具有統計學意義，提示在體內實驗中康萊特對放療具有協同作用。

下咽癌患者預后的最重要指標是頸部淋巴結或遠處器官轉移，轉移可以通過血管、淋巴管或直接進入組織或體腔。區域淋巴結往往是轉移的第一站，原因可能是腫瘤細胞通過豐富的淋巴管網轉移或新生毛細淋巴管實現。腫瘤淋巴管生成是已知的促進淋巴轉移的因素。VEGF-C可以刺激腫瘤淋巴管生成，促進腫瘤向區域淋巴結及遠處轉移，是腫瘤轉移過程中腫瘤淋巴管生成的重要生長因子。本研究免疫熒光染色結果顯示，單純放療組中新生微血管較多。康萊特聯合放療組癌細胞周圍間質微血管存在一定缺失。提示康萊特可以減少移植瘤微血管形成，并減少腫瘤細胞的再次增殖。Periostin是一種細胞外基質相關分子，主要參與調控細胞的生存、黏附和侵襲，在多種惡性腫瘤中均高度表達且能促進腫瘤的遠處轉移[9，10]。在Periostin的調控機制中，主要涉及到基于整合素與特定蛋白質結后激活下游相關信號通路，包括ERK1/2和PI3K/Akt[11-13]。為了證實康萊特與放療是否影響ERK1/2和PI3K/Akt通路的活性，本實驗檢測了兩者磷酸化水平。結果發現盡管單純康萊特或放療均可在一定程度上降低其磷酸化水平，但聯合應用后其活性進一步降低。隨后我們也檢測了下游Periostin和VEGF-C的表達變化[14，15]。與預期一致，康萊特特聯合放療后Periostin和VEGF-C表達顯著減少。以上結果表明康萊特聯合放療后抑制ERK1/2和PI3K/Akt通路的激活，最終通過降低Periostin和VEGF-C的表達而抑制腫瘤生長。

綜上所述，康萊特聯合放療可通過抑制ERK1/2和PI3K/Akt通路的激活，降低腫瘤組織中Periostin和VEGF-C的表達而抑制腫瘤內部微血管生成，減少細胞增殖，為進一步研究其在頭頸腫瘤中的作用提供了依據。

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（收稿日期：2019-07-31）