甜高粱莖稈持汁性研究進展

冷傳遠 郝懷慶 景海春

（1. 中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室，北京 100093；2. 中國科學院大學，北京 100049）

高粱（Sorghum bicolor）是世界第五大禾谷類作物，是干旱及半干旱地區的主要糧食作物（http：//www.fao.org）。高粱為C4植物，光合效率高，生物產量大。此外，高粱具有較強的抗逆性和適應性，被稱為“沙漠中的駱駝”。高粱品種BTx623于2009年完成全基因組測序，其基因組約為730 Mb，是玉米全基因組的1/3。因其基因組較小，重復序列少的特點，使其成為研究甘蔗亞族和其他C4作物功能基因組學的一個較好的模式作物［1］。甜高粱是普通高粱的變種，屬于禾本科（Gramineae），高粱族（Andropogoneae）高粱屬（Sorghum）甜高粱種［Sorghum bicolor（L.）Moench］栽培甜高粱亞種［Sorghum bicolor（L.）Moench subsp.bicolor］。甜高粱用途廣泛，可用于生產糧食、糖漿、酒精及青貯飼料等，被公認為是重要的基于糖、淀粉發酵生產乙醇的第一代能源植物和基于纖維素發酵生產乙醇的第二代能源植物［2-6］。

1 高粱莖稈持汁性的意義

甜高粱作為上述這些產業的重要原料，是因為其莖稈富含水分和糖分。莖稈占甜高粱生物學產量的70%，是甜高粱重要的能量儲存器官［7］，含有蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖。它們是生產乙醇、提高青貯飼料品質的主要原料［8-9］。

高粱莖稈中的水分是糖分等光合產物的主要載體，莖稈出汁量對甜高粱的產糖量非常重要。黎大爵和廖馥蓀用出汁量和汁液錘度（Brix）（錘度表示汁液中可溶性糖的含量）估算莖稈用于發酵的可溶性糖的產量，即莖稈中可發酵糖分產量=出汁量×錘度［10］。Sankarapandian等［11］的研究表明在乙醇生產過程中莖稈出汁量的貢獻率高達122.6%。陳連江等［12］得出甜高粱莖稈出汁量與生物產量、汁液錘度、糖分含量等品質性狀間相關性均達到顯著或極顯著水平。趙香娜等［13］認為出汁量與錘度呈極顯著正相關；錘度與單株莖稈鮮重呈極顯著正相關。Guan等［14］也認為莖稈中糖產量受株高、莖和葉鮮重、莖稈中汁液的錘度及重量的影響。Sanjana Reddy等［15］的研究表明提高莖稈出汁量能顯著提高莖稈糖產量。

此外，甜高粱有很大一部分被用作青貯飼料的制作。青貯飼料是將含有一定水分的新鮮青綠植物材料經切碎后放在密閉容器內，通過微生物（乳酸菌）厭氧發酵，達到保存、保鮮目的而制成的飼料［16］。適宜的水分含量對于青貯飼料的品質有重要影響。一般青貯原料水分含量要求為65%-75%，水分含量較低或者較高都會對青貯飼料的品質產生不利影響［16-18］。水分含量較低，會導致原料在青貯時不易被壓實，窖內殘留空氣，使原料發霉變質；同時含水量降低還會使原料在青貯過程中產熱過多，使pH值升高乙酸含量增加，乳酸菌及其他一些發酵產物含量降低。青貯原料的含水量過高，首先是滲液問題，不僅會喪失大量養分，對環境造成不利影響，同時高水分易引起梭菌生長，降低發酵品質。

鑒于甜高粱莖稈中水分的重要作用，克隆與鑒定調控高粱莖稈水分的基因，揭示其遺傳規律和分子機理具有重要的理論價值和應用價值。中國高粱種質資源豐富，栽培歷史悠久，所以多年來關于中國高粱的起源和進化問題一直為國內外學者所關注，而從目前所掌握的資料來看，都認為甜高粱是從非洲傳入中國的［19］。通過挖掘與重要性狀相關的功能基因，通過群體選擇分析探究各亞群的多態性和分化程度，進而探討群體的遺傳結構、基因交流、物種形成機制及群體進化動態問題是當前的研究熱點［20-23］。莖稈持汁性作為甜高粱的重要特征，對其進行深入研究不僅有助于了解控制莖稈持汁性的關鍵基因及具體生物學功能，還有助于了解甜高粱的起源和馴化過程。

2 高粱莖稈持汁性的研究歷程

2.1 Dry/D基因的定位與克隆

人們克隆與鑒定調控高粱莖稈水分的基因主要圍繞葉脈顏色、持汁性、含水量和汁液產量進行。Benson和SubbaRao［24］于1906年首次發現當高粱莖稈無汁時，葉片中脈呈白色；當有汁時，葉片中脈的顏色為綠色。通過構建遺傳群體，研究發現莖稈持汁性受單基因控制，莖稈有汁為隱性，基因型為d，莖稈無汁為顯性，基因型為D［25-27］。后續的實驗發現控制莖稈水分的D基因與控制高粱幼苗出土時莖尖顏色的Rs基因和控制葉鞘紫色的P基因存在連鎖，Rangaswami等［27］研究表明在高粱中控制葉鞘紫色的P基因與控制莖稈含汁性的D基因的重組率為30%。D的精細定位最初是通過葉脈的顏色來進行的。通過將葉脈分為白脈和綠脈，Xu等［28］將D基因定位到SBI-06上兩個RFLP標記（umc34和txs1030）之間，Hart等［29］認為D基因與SSR標記txp97連鎖。2010年，Mace等［30］通過“projection strategy”的方法將D基因定位到SBI06上84.2-93.2 cM之間，與SSR標記txp145緊密連鎖。2014年Zhai等［31］對兩套獨立的F2群體觀察分析，將D基因鎖定在6號染色體上只包含6個候選基因的區間范圍內。

以高粱莖稈的出汁量或者含水量作為指標，研究認為高粱莖稈水分含量是數量性狀，受到多個QTL位點控制。通過測量不同節間的含水量，Han等［32］定位到一個控制高粱莖稈含水量的顯著位點，位于6號染色體上Ch6-2和gpsb069之間，其對各個節間含水量變異的解釋率為34.7%-56.9%，進一步通過BSA測序的方法，將這一區間縮小到339 kb，包含38個候選基因。這一位點與之前報道的控制葉脈顏色的位點相同。此外，也發現了其他的一些QTL位點。Felderhoff等［33］分別以出汁量和含水量為指標，發現在1號、3號、4號和7號染色體上存在顯著的QTL位點。Guan等［14］以出汁量為指標，將控制莖稈出汁量的位點定位到了染色體SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061區間，染色體SBI-04的Sb1_10-SbAGG02區間，染色體SBI-07的SbAGF06-Xcup19區間和染色體SBI-09的Sb5_206-SbAGE03區間，其中位于染色體SBI-07和SBI-09的區間在兩種自然環境下均能檢測到。然而，由于作圖親本的選擇和自然環境的影響，在這些研究中并沒有發現D位點與莖稈中的水分相關。2015年，Burks等［34］通過全基因組關聯分析的方法將控制葉脈顏色的位點、出汁量的位點和含水量的位點同時定位到6號染色體——51.8 Mb的區域。這些研究說明含水量是受多基因控制的數量性狀，而最初定義的控制汁液有無的單基因D是控制含水量、出汁量的主效基因。對D基因研究的突破性工作出現在2018年。Zhang等［35］將高粱的莖稈分為“pithy”和“juicy”兩類，通過全基因組關聯分析和圖位克隆的方法，最終克隆到了控制高粱莖稈持汁性的D基因，并將其命名為Dry，并且進一步通過轉基因的手段驗證了Dry基因的功能。該基因編碼植物特有的NAC轉錄因子，其功能缺失是甜高粱莖稈富含汁液的重要原因。同年，Fujimoto［36］、Xia［37］和 Casto［38］也分別通過圖位克隆的方式鑒定到D基因，并且Fujimoto［36］通過異源表達的方式在擬南芥中驗證了D基因的功能，而Xia等和Casto等并沒有對D基因的功能進行驗證。

2.2 Dry基因的作用機制

通過細胞學及生理生化實驗，Zhang等［35］發現Dry基因參與次生細胞壁的合成，Dry功能缺失會影響甜高粱莖稈髓部維管束和薄壁細胞的形態、細胞壁厚度及細胞壁組分。進化樹分析表明Dry與控制次生細胞壁合成的VND、NST和SMB基因家族親緣關系較近［35］。同時也發現，在Dry基因功能喪失的材料中與纖維素、半纖維素合成相關的MYB轉錄因子和功能基因的表達也發生變化，因此Dry是一類新的控制次生細胞壁合成相關的基因［35］。推斷當Dry基因功能喪失以后，不利于水分在高粱莖稈內的運輸，因此甜高粱莖稈內積累了大量的水分。

在Fujimoto等［36］的研究中，他們發現Dry基因與程序化細胞死亡有關。Dry基因在擬南芥中的同源基因是ANAC074，將Dry基因在ANAC074的突變體中異源表達，取擬南芥的花序軸，用伊文思藍進行染色，發現花序軸被染成藍色。利用雌激素誘導系統，發現當添加雌激素后，表達LexA∷D和LexA∷ANAC074的擬南芥細胞的細胞核和質體發生丟失。同時表達LexA∷D和LexA∷ANAC074的擬南芥細胞以及D/d的高粱近等基因系材料中，檢測到與程序化細胞死亡相關基因，如CEP1和XCP1家族的肽酶相關基因，編碼type-II metacaspases的基因，PASPA3、SCPL48、BFN1和RNS3的表達發生變化。在Casto等［38］的試驗中，他們也發現程序化細胞死亡的標志基因SbXCP1在SbNAC_D的近等基因系中的表達量顯著高于在SbNAC_d1的近等基因系中的表達量，并且在高粱品種R07020中，SbXCP1的表達量與通氣組織的形成相關。

2.3 Dry基因在高粱的起源馴化過程中受到選擇

Zhang等［35］通過PCA分析發現，野生高粱、籽實高粱和甜高粱能非常明顯的區分開。此外，全基因組水平的LD分析發現三者的衰減速度為野生高粱＞籽實高粱＞甜高粱。這說明甜高粱可能經歷了比籽實高粱更強的選擇馴化過程。野生高粱和籽實高粱莖稈中的水分含量很低，而甜高粱的莖稈中含有大量水分，因此推測Dry基因可能在高粱的起源和馴化中起重要作用。進一步通過XP-CLR證實了在甜高粱Dry處存在明顯的正選擇信號，并且Dry的核酸多態性低于野生高粱和籽實高粱［35］。對Dry基因的單倍型進行分析，發現在野生種中存在23種單倍型，在籽實高粱中僅存在2種單倍型（Pithy_SUD和Pithy_CHN），在甜高粱中存在4種單倍型（Juicy_IND、Juicy_RSA、Juicy_ZIM 和 Juicy_USA），并且籽實高粱的2種單倍型與野生高粱的353_type和394_type是相同的。進化樹分析發現甜高粱Juicy_IND是由籽實高粱Pithy_CHN產生的［35］。因此Dry在甜高粱的起源與馴化過程中受到選擇，Dry基因從野生高粱馴化為栽培無汁高粱受到瓶頸效應，導致遺傳多態性降低；篩選Dry突變體是選育有汁甜高粱的關鍵一步。

3 展望

3.1 高粱莖稈持汁性與葉脈顏色之間的關系

通過農桿菌介導的方法將Dry基因導入甜高粱品種Keller，盡管Keller莖稈的持汁性發生變化，但是葉脈的顏色并沒有從綠色變為白色。因此我們認為Dry并不是控制葉脈顏色的主要基因，而是與之緊密連鎖。控制葉脈顏色的基因與Dry緊密連鎖在一起，可能是由于葉脈的顏色易于觀察，因此在育種過程中人們有意識的選擇造成的。Xia等［37］通過GWAS和圖位克隆的方法將控制葉脈顏色的基因定位到了6號染色體上——36 kb的區間。在該區間包含除Dry基因以外的3個基因。明確其中哪一個基因決定了葉脈顏色還需要進一步研究。

3.2 莖稈持汁性與莖稈含水量之間的關系

Burks 等［34］利用GWAS的方法將控制水分含量和出汁量的基因定位到了Dry基因所在的位置，此外在1號染色體和5號染色體上也存在與含水量相關的顯著位點。Guan等［14］以出汁量為指標，將控制莖稈出汁量的位點定位到了染色體SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061區間，染色體SBI-04的Sb1_10-SbAGG02區間，染色體SBI-07的SbAGF06-Xcup19區間和染色體SBI-09的Sb5_206-SbAGE03區間。因此，在Dry基因控制莖稈持汁性的基礎上，還需要對調控莖稈水分含量相關的其他微效基因進一步挖掘，以便為深入了解莖稈水分含量的精細調控機理奠定理論基礎。

3.3 莖稈持汁性與莖稈含糖量之間的關系

由葉片光合作用生成的光合產物，主要以蔗糖的形式運輸到各個庫器官，而莖稈中的水分是糖分等光合產物的主要載體。在甜高粱莖稈中，光合產物主要以可溶性糖的形式儲存于莖髓部薄壁細胞中，可溶性糖的積累會引起滲透壓的提高，這是否會影響水分的吸收，或者水分含量是否會影響可溶性糖的積累都是需要進一步明確的問題。在前人的研究中也發現了同時控制水分量和Brix的QTL位點。但是植物如何調節其自身的水分含量和糖含量使其達到平衡目前尚未可知。此外，目前對于高粱莖稈中糖含量的測定主要是通過測定Brix進行的，然而Brix的測定較為粗糙，受環境和發育時期的影響較大。同時高粱中的糖分除了蔗糖之外，還包含葡萄糖、果糖和淀粉等。因此精準定量高粱莖稈中的各種糖分含量、水分含量與糖分含量之間的關系也是今后的研究重點。

3.4 莖稈持汁性與籽實大小之間的關系

在甜高粱中，莖稈和籽實都是儲能器官。研究發現莖稈和籽實之間存在能量競爭關系，然而目前對這方面研究的并不深入。這方面的研究可以幫助詮釋作物/植物莖稈儲水在水分與養分轉運、“源-庫”信號交換方面的作用。另外，甜高粱各品種間籽實的大小也存在差異，因此對甜高粱籽實差異的研究有可能找到甜高粱特異的調控籽實大小的途徑。

3.5 莖稈持汁性與持綠間的關系

Dry基因在擬南芥中的同源基因是At4g28530。研究發現在葉片衰老過程中At4g28530的表達量升高［39］。Dry基因在水稻中的同源基因是Os4g43560。研究發現在適度干旱的條件下，Os4g43560在耐旱材料的幼穗中表達量升高，而在不耐旱的材料中表達量未發生變化［40］。在高粱中我們也發現籽實高粱的衰老普遍早于甜高粱，因此Dry基因在衰老中的作用也是今后的一個重要研究方向。

綜上所述，甜高粱莖稈水分含量是由多基因控制的，目前只克隆到一個主效基因Dry，但是對于其作用機理和調控網絡并不十分清楚，仍需進一步深入研究。同時，克隆其他控制基因對精細調控莖稈水分含量，明確莖稈持汁性對莖稈物質積累和同化產物競爭有無作用具有重要理論價值和應用價值。