納米佐劑在抗病毒疫苗中的應(yīng)用

梁皓，胡秦，盛望

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124

1796年，愛德華·詹納發(fā)現(xiàn)接種牛痘可以預(yù)防天花的發(fā)生，這種預(yù)防方法隨后被廣泛傳播，世界上第一種有效的疫苗由此誕生。在之后的200多年中，針對多種病毒的疫苗得以快速發(fā)展，并在許多流行病的預(yù)防與控制中取得成功。目前的疫苗主要為減毒活疫苗、滅活病毒疫苗和亞單位疫苗。減毒活疫苗保存條件嚴(yán)格且自身存在一定毒力，有導(dǎo)致疾病本身的風(fēng)險，而滅活病毒疫苗和亞單位疫苗與之相比免疫原性較弱，需要多次免疫[1]。納米材料在疫苗領(lǐng)域中的應(yīng)用有效地解決了免疫持續(xù)時間短與免疫原性差的問題，納米佐劑疫苗將成為未來疫苗研究的新趨勢。在此，我們簡要綜述了納米佐劑的特點與類型，及其在艾滋病、乙型肝炎、流感等病毒相關(guān)性疾病中的應(yīng)用。

1 納米佐劑的特點

納米佐劑是一種可以遞送抗原，增強抗原免疫原性并防止抗原被酶提前降解的尺寸為1～1000 nm的納米顆粒[2]。納米佐劑的尺寸是影響它免疫原性的重要因素之一。納米疫苗從外周血有效進(jìn)入淋巴節(jié)會提高抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）對納米疫苗的攝入，而物質(zhì)進(jìn)入淋巴管取決于其尺寸，20～200 nm的物質(zhì)可以輕松地通過淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)[3]。實驗證實，小分子聚合物納米顆粒（25 nm）在注射進(jìn)小鼠體內(nèi)后可以到達(dá)淋巴節(jié)并停留至少120 h，且觀察到巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）對納米顆粒的攝取，證明納米顆粒的尺寸影響其在小鼠體內(nèi)二級淋巴系統(tǒng)中的動力學(xué)分布[4]。

納米佐劑易于生產(chǎn)和可增強免疫原性的特點，使其成為一個極具吸引力的用于遞送抗原的平臺。單一的抗原可以重復(fù)地展示在納米顆粒的表面，這是免疫佐劑可以增強免疫原性的另一個重要原因。不僅如此，納米佐劑還可以同時包裹多種抗原形成多價疫苗，或者同時將抗原與其他佐劑（如CpG ODN、Poly I∶C等）組裝在一起，大幅度地增強了體液免疫與細(xì)胞免疫的效果。Tao等將M2e多肽和CpG結(jié)合到金納米顆粒上形成納米疫苗，用來預(yù)防甲型流感病毒[5]。實驗結(jié)果證實，在小鼠體內(nèi)，這種納米疫苗引起了很高的抗M2e的抗體水平，IgG1和IgG2a均有大幅提高。在多個甲型流感病毒毒株的致死劑量下，免疫了納米疫苗的小鼠得到了100%的保護(hù)，從而證明此疫苗有著優(yōu)秀的廣譜預(yù)防效果。

2 納米佐劑的種類

關(guān)于納米佐劑的選擇，首先應(yīng)考慮的是需要包裝與遞送的抗原類型。目前已發(fā)展出多種材料可以作為納米佐劑，這些材料分為無機與有機兩大類。無機材料包括金納米顆粒、碳納米顆粒等。它們有很多優(yōu)點，如材料性質(zhì)均一穩(wěn)定，有一定的結(jié)構(gòu)硬度等，但是在體內(nèi)，無機納米材料不容易降解，會引起持續(xù)的炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞纖維化[6]。

相對而言，有機材料容易降解，不存在細(xì)胞毒性，由此發(fā)展出了多種納米佐劑。脂質(zhì)體是其中最常用的一種，它可以將病毒抗原包裝在脂質(zhì)體內(nèi)，通過膜融合使抗原進(jìn)入細(xì)胞[7]。殼聚糖已被批準(zhǔn)作為輔藥用于多種試劑中，顯示出良好的耐受性與安全性，可作為納米佐劑應(yīng)用于黏膜免疫[8]。聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種可生物降解的高分子材料，可以有效地保護(hù)包裝在內(nèi)的抗原與佐劑，免除酶的破壞，起到長期的緩釋遞送效果[9]。

3 納米佐劑的應(yīng)用

3.1 人免疫缺陷病毒

人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是導(dǎo)致艾滋病的元兇，是全球范圍內(nèi)對人類健康危害最為嚴(yán)重的傳染病之一[10]。納米佐劑聯(lián)合傳統(tǒng)的HIV疫苗是預(yù)防和治療艾滋病的有效手段[11]。首先，納米佐劑提供了一個更好的遞送途徑，可以幫助HIV疫苗更有效地通過體內(nèi)的物理屏障；并且納米佐劑的緩釋作用可以提高HIV疫苗的半衰期，延長體內(nèi)的循環(huán)時間。其次，納米佐劑本身干擾HIV的組裝過程，從而抑制HIV復(fù)制。最后，納米佐劑可以減輕HIV藥物或疫苗帶來的毒副作用[12]。

功能化的金屬材料，如金、銀、鉑，都可以成為遞送HIV疫苗的納米佐劑。在少數(shù)HIV廣譜單克隆抗體中，2G12是惟一的碳水化合物靶向的抗體，它可以識別病毒包膜蛋白gp120表面高聚甘露糖[13]。Marradi等設(shè)想用寡聚甘露糖苷包裹的金納米顆粒發(fā)展成一種疫苗，希望能夠誘導(dǎo)出2G12樣的抗體，干擾HIV通過gp120介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[14-15]。這種納米顆粒可以抑制2G12抗體與gp120的結(jié)合，并阻礙2G12抗體介導(dǎo)的HIV中和。Di Gianvincenzo等發(fā)現(xiàn)帶負(fù)電荷的糖基化金納米顆粒可以使gp120上V3多肽的α螺旋與β片層結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[16]。與普通的V3多肽相比，納米佐劑的使用使V3免受蛋白酶的降解而更加穩(wěn)定。負(fù)載V3的納米顆粒在兔子體內(nèi)誘導(dǎo)出可以識別gp120重組蛋白的抗體，兔子體內(nèi)的血清展現(xiàn)出持續(xù)的中和活性。這項研究為全合成HIV疫苗的設(shè)計提供了參考。

第一個使用脂質(zhì)體遞送HIV抗原的的研究已有20多年歷史[17]，這種遞送方式吸引了眾多研究人員的目光。HIV脂質(zhì)體納米疫苗的成分、大小、脂質(zhì)體的類型、HIV抗原和遞送方式等都得到了大量研究。Philips等評估了不同脂質(zhì)體成分對HIV免疫應(yīng)答效果的影響[18]。結(jié)果顯示，無論是二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）脂質(zhì)體還是二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）脂質(zhì)體都比傳統(tǒng)的鋁佐劑誘導(dǎo)出更強的HIV gp120特異性IgG抗體。

聚交酯（PLA）是一種很好的生物醫(yī)藥材料，也是最常用的一種HIV疫苗遞送聚合物。Lamal?le等將HIV p24抗原與gp120包膜糖蛋白共同吸附在PLA納米顆粒表面，發(fā)現(xiàn)納米顆粒表面抗原的免疫原性被很好地保留下來，并且這種PLA納米疫苗可比MF59誘導(dǎo)出更強的抗體滴度[19]。Cli?ment等同樣用PLA包載HIV Gag抗原p24制作出的納米顆粒可以誘導(dǎo)DC成熟，細(xì)胞因子和趨化因子分泌，增加HIV特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增[20]。

此外，PLGA也可作為納米佐劑用于HIV疫苗。Zhou等用PLGA和聚乙烯亞胺（PEI）形成包含HIV DNA疫苗的納米微球。這種納米微球能夠改善DNA遞送到APC的效果，并且在體外可以持續(xù)釋放長達(dá)2周。PLGA納米微球保護(hù)了DNA疫苗免受DNA酶的降解，顯著提高了血清中的抗體水平和CTL的數(shù)量[21]。

3.2 乙型肝炎病毒

世界衛(wèi)生組織評估世界上約有2.6億乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）攜帶者。慢性HBV感染將會導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌的發(fā)生[22-23]。目前，乙肝疫苗使用的是以氫氧化鋁作為佐劑的HBV表面抗原（HBsAg）組成的病毒樣顆粒（VLP）。但鋁佐劑存在許多不足，它會引起炎癥反應(yīng)、自身免疫和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，并且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)偏向于Th2型，不適合需要CTL為主導(dǎo)的治療方案[24-25]。初步研究表明，納米佐劑可以幫助HBV疫苗更有效地遞送抗原，誘導(dǎo)TH1型免疫反應(yīng)，且減少佐劑帶來的毒副作用。

其中一項研究用PLGA吸附HBsAg與TLR9激動劑CpG形成納米疫苗[26]。當(dāng)其通過肌肉注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，不僅可以激活相關(guān)抗體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)出HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞，還檢測到相關(guān)細(xì)胞因子與趨化因子分泌的提高。另一項同樣使用PLGA作為納米佐劑遞送HBsAg的研究中[27]，發(fā)現(xiàn)此納米疫苗可以顯著增強血清中特異性抗體的分泌，在免疫納米疫苗5周后，血清中抗HBs抗體濃度可達(dá)800 mIU/mL；而只免疫HBsAg不加PLGA納米佐劑的小鼠血清中，特異性抗體的濃度只有不到100 mIU/mL。

感染HBV的成年人中只有5%～10%會發(fā)展成慢性肝炎，但是由母嬰途徑傳播遭受HBV感染的新生兒約90%都會發(fā)展成慢性肝炎[28]。這是由于新生兒免疫系統(tǒng)中DC產(chǎn)生的IL-12水平較低，整體免疫反應(yīng)偏向Th2型[29]。Pietrzak等用單磷酰脂質(zhì)A（MPLA）作為納米佐劑遞送HBsAg[30]。這種納米疫苗可以刺激新生兒臍帶血來源的DC成熟并產(chǎn)生IL-12，成熟后的DC還可以進(jìn)一步激活特異性T細(xì)胞擴(kuò)增并分泌IFN-γ，而傳統(tǒng)的HBsAg病毒樣顆粒無這種效果。

3.3 流感病毒

目前，預(yù)防流感最有效的方式是接種三價流感滅活病毒疫苗（TIV）。TIV的免疫方式是肌肉注射，產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫，黏膜免疫效果有限[31-32]。而流感主要通過飛沫傳播，所以，最理想的流感疫苗應(yīng)產(chǎn)生很強的呼吸道黏膜免疫反應(yīng)。越來越多的研究開始關(guān)注通過加入納米佐劑生產(chǎn)出適于黏膜免疫的流感病毒疫苗。

Dehghan等開發(fā)出一款通過鼻黏膜免疫的納米疫苗[33]，他們用殼聚糖納米佐劑包裹流感全病毒（WV）加上CpG共同免疫兔子，90 d后，兔子體內(nèi)產(chǎn)生了大量IgA型血球凝集素抑制性抗體，同時檢測到IL-2與IFN-γ的分泌提高，免疫效果明顯優(yōu)于單獨使用WV。另一項研究用聚酐納米佐劑包載H5血球凝集素三聚物（H53）產(chǎn)生預(yù)防H5N2的納米疫苗[34]。用這種納米疫苗免疫小鼠可以產(chǎn)生高水平的抗體滴度并增強CD4+T細(xì)胞的反應(yīng)。當(dāng)用致死劑量的病毒感染免疫后的小鼠時，納米疫苗免疫后的小鼠得到良好的保護(hù)。Singh等發(fā)現(xiàn)用納米佐劑將疫苗制成氣溶膠可以產(chǎn)生良好的黏膜免疫效果[35]。在這項研究中，福爾馬林滅活的H9N2病毒與CpG共同包載到PLGA中。與滅活病毒相比，此種方法形成的納米疫苗可以在呼吸道黏膜表面停留更長時間，產(chǎn)生更強的血球凝集素抑制性抗體。

3.4 腸道病毒71型

腸道病毒71型（EV71）是手足口病（hand,foot and mouth disease，HFMD）的主要病原體之一[36]。過去的20年中，由EV71引起的HFMD在亞太地區(qū)廣泛流行，嚴(yán)重威脅兒童生命健康[37-40]。盡管通常HFMD病情溫和，但也有一些病人會產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)和心臟系統(tǒng)并發(fā)癥，最終危及生命[41]。

γ聚谷氨酸（γ-PGA）是一種水溶性的可生物降解的多聚物，Pathinayake等選用γ-PGA與殼聚糖組裝成的納米佐劑（PC）負(fù)載EV71滅活病毒生成一種全新的納米疫苗[42]。經(jīng)皮下注射后，高水平的體液免疫與細(xì)胞免疫被誘導(dǎo)出來，病毒特異性的抗體與細(xì)胞因子（IFN-γ和IL-4）均大幅提升。與單獨免疫滅活病毒相比，這種納米疫苗產(chǎn)生了更加強烈、持續(xù)的免疫效果，并且未觀察到有任何毒副作用。

除EV71滅活病毒外，EV71亞單位疫苗也得到了廣泛的開發(fā)。由于亞單位疫苗的免疫原性較差，納米佐劑的使用顯得更加重要。Qiao等將殼聚糖與肝素組成納米佐劑，共遞送EV71的VP1多肽和CpG或腫瘤壞死因子α（TNF-α）[43]。由于形成的納米疫苗尺寸分布可以控制在90～130 nm之間，所以經(jīng)皮下注射后，納米疫苗可以進(jìn)入淋巴結(jié)并停留很長時間。這種策略增強了疫苗的免疫效果，不僅誘導(dǎo)出很強的Th1型免疫反應(yīng)，還擁有不錯的Th2型免疫效果。此外，EV71特異性IgA的分泌水平顯著提高，證明這種疫苗既可產(chǎn)生系統(tǒng)性的免疫反應(yīng)，也有優(yōu)秀的黏膜免疫保護(hù)效果。

4 結(jié)語

納米佐劑可以延長抗原在體內(nèi)的停留時間，保持抗原的穩(wěn)定性，增強抗原的免疫原性。因此，納米佐劑疫苗有很大的潛力發(fā)展成為病毒預(yù)防與治療的最佳手段。不同免疫調(diào)節(jié)劑或模式識別受體相關(guān)的激動劑與納米佐劑的聯(lián)合使用，將讓疫苗的免疫效果得到進(jìn)一步的提升。目前，為了清晰地理解納米佐劑的免疫調(diào)劑機制，大量臨床前研究與臨床研究正在火熱進(jìn)行中。隨著研究的深入，納米佐劑將為病毒疫苗免疫提供一個更加安全有效的遞送系統(tǒng)。