呼吸道合胞病毒疫苗研究進展

張樂,劉波,吳軍

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是世界范圍內引起嬰幼兒病毒性急性下呼吸道疾病（acute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原體[1]。每年約有3400萬兒童感染RSV，其中約340萬須住院治療，約導致20萬人死亡，且99%的死亡發生在發展中國家[2]。針對阿根廷56 560名兒童的研究顯示，有1293名兒童患有呼吸道感染，61.6%感染了RSV，其中13%已威脅了生命[3]。在美國，5歲以下兒童門診患者中也有很大比例系由RSV引起[4]。此外，RSV感染的目標人群還包括老年人及免疫抑制人群。對于免疫功能低下患者，尤其是患有血液系統惡性疾病和接受人體干細胞移植的患者，面臨著患嚴重RSV相關疾病的風險[5]。目前對于RSV的防治主要采用被動免疫，1996年獲批的RSV免疫球蛋白（RSV-IVIG，RespiGam）可顯著降低高危兒童的住院率[6]，但因其需要靜脈注射以及存在血液傳播病原體的潛在風險，從2004年開始逐漸退出市場。帕利珠單抗（palivizumab）Synagis（MedImmune公司）是惟一獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）認可的人源化單克隆抗體，然而由于高成本，使得帕利珠單抗的使用目前僅限于高危嬰兒的小眾群體[7]。帕利珠單抗的突變體Motavizumab（MedImmune-AstraZeneca公司），雖被證明比帕利珠單抗具有更高的病毒中和作用[8]，但由于少數治療的嬰兒出現皮膚過敏反應，未能得到美國FDA的批準[9]。而廣譜的抗病毒臨床藥物利巴韋林因出現不良反應且毒性高，也較少用于RSV感染的治療。因此，研制安全有效的RSV疫苗十分重要，世界衛生組織也將研制RSV疫苗列為全球疫苗計劃的優先發展計劃之一[10]。

1 呼吸道合胞病毒的生物學特征

呼吸道合胞病毒屬副黏病毒科肺炎病毒屬，病毒粒子直徑為150～300 nm，是不分節段的單股負鏈RNA，由編碼3種跨膜表面蛋白（F、G和SH）、2種基質蛋白（M和M2）、3種核殼蛋白（N、P和L）及2種非結構蛋白（NS1和NS2）的15 222個核苷酸組成[11]。

基因組由核殼蛋白（N）包裹，通過聚合酶（L）催化RNA的合成并對mRNA進行加帽、加多聚腺苷酸尾。P蛋白是一個與N、L和M2-1蛋白相互作用的同源四聚體，是聚合酶的必要輔助因子，其C端與N蛋白的C端相互作用以打開核糖核蛋白結構，使聚合酶結合到病毒RNA上；此外，P蛋白與新合成的N結合，阻止錯誤裝配[12]。M2-1和M2-2是RNA合成因子，M2-1是轉錄調節因子，當其缺失時轉錄會提前終止[13]。非結構蛋白NS1和NS2通過阻斷干擾素的誘導和信號傳遞，抑制宿主的免疫應答[14-15]。SH蛋白形成陽離子通道的五聚體結構并抑制感染的細胞凋亡[16]。RSV感染主要由糖蛋白F和G介導，黏附蛋白（G）與宿主細胞膜黏附，促使病毒吸附于細胞表面[17]，融合蛋白（F）介導病毒包膜與宿主細胞膜融合，使病毒進入細胞，在病毒融合和進入期間，F蛋白從亞穩定的融合前構象（pre-F）轉變為穩定的融合后構象（post-F）[18]。F蛋白和G蛋白具有較高的免疫原性，可刺激機體產生血清中和抗體。由于F蛋白在病毒包膜外，具有特異性抗原決定簇；亞型間序列較為保守以及膜融合過程中具有關鍵作用，可引起膜融合的顯著構象變化等[19]，使得F蛋白成為RSV抗病毒藥物及疫苗研發的重要靶點。

2 呼吸道合胞病毒的流行病學研究

RSV是一種高度傳染性的病毒，在人一生中會重復感染。雖然病毒很容易在非人靈長類動物體內感染，且可能引起嚴重疾病，但人類是RSV的惟一天然宿主。RSV感染流行主要發生在溫帶地區的深秋、冬季和早春，以及部分熱帶地區的雨季[20]，我國北方RSV感染主要發生在春冬季，南方多發生在夏秋季。大多數兒童在出生的第1年就感染了RSV，第2年幾乎全部感染。反復感染RSV在生命的最初幾年頻繁發生。有研究顯示，在1歲以內感染的兒童中，47%會在第2年再次感染，再次感染不依賴于抗原差異，下呼吸道感染會在首次及再次感染期間發生，但是在隨后的感染中發病的嚴重程度顯著降低，這可能反映了獲得性免疫的增加。RSV感染出現嚴重住院最常見的是6周至6個月齡的嬰兒，其中在2～3月齡的嬰兒中發病率最高[21]。

3 呼吸道合胞病毒疫苗發展

安全有效的RSV疫苗應能防止高危人群因感染RSV而出現下呼吸道疾病，降低住院率及死亡率。20世紀60年代初研制的RSV-福爾馬林滅活 疫 苗（formalin-inactivated RSV vaccine，FIRSV），對2月齡嬰兒及7歲兒童肌肉注射并進行觀察，結果發現并無保護作用，相反，2名接種的嬰兒因感染野毒株型RSV而導致死亡，具體原因尚未完全明確。研究認為，福爾馬林處理RSV，改變了病毒上的膜蛋白，誘導了非中和抗體應答反應，該滅活疫苗未能誘導有效的CD8+T細胞，致使RSV不易被清除。同時，由于沒有有效的中和抗體和CD8+T細胞，RSV在下呼吸道中持續存在并誘導侵襲性的CD4+T細胞和細胞因子應答，介導的炎癥反應導致病情加重，即增強的RSV疾病（enhanced RSV disease，ERD）[22]。RSV復制和持續炎癥導致嬰兒氣道阻塞，造成了一定的發病率和死亡率。FI-RSV疫苗事件及動物模型實驗中觀察到的疾病增加，提示對于血清反應陰性的嬰兒和兒童，RSV疫苗應能誘導保護性的中和抗體及CD8+T細胞，并誘發與野毒株相似的CD4免疫反應，即復制型疫苗適合該類人群；對于高危大齡兒童、老年人可采用非復制型RSV疫苗。

在開發有效的RSV疫苗方面，另一個挑戰涉及到免疫原性的問題，嬰兒免疫系統不成熟，同時存在母體抗RSV的抗體；老年人免疫力低，降低了對疫苗的反應，因此應針對不同人群研制相應的RSV疫苗，并選擇合適的受試人群。目前RSV疫苗的研究主要集中在減毒活疫苗、病毒載體疫苗及亞單位疫苗等方面。

3.1 減毒活疫苗

相對于非復制性疫苗，減毒活疫苗有幾個優點，尤其是對于從未接觸過RSV的嬰兒和低齡兒而言：鼻內接種減毒活疫苗可誘導產生全身和局部免疫，因此可同時對抗上、下呼吸道感染；人體對活疫苗的免疫反應和自然感染十分相似，因此暴露于野毒株后不會發生更嚴重的疾病[23]；與其他鼻內給藥的呼吸道減毒活疫苗一樣，鼻內給藥的RSV侯選苗在存在母傳抗體的低齡兒體內可以復制，這對于RSV減毒活疫苗在低齡嬰兒體內取得成功十分關鍵。

RSV減毒活疫苗的研究策略主要包括構建宿主范圍突變體、低溫傳代（cp）突變體[24]和溫度敏感（ts）突變體[25]等疫苗。但這些疫苗要么減毒不夠（cp RSV和RSV ts-1）[26]導致傳播RSV，引起感染；要么減毒過度（RSV ts-2）[27]導致缺失免疫原性。幸運的是當接種了cp RSV和RSV ts-1的嬰幼兒自然感染RSV野毒株時，并沒有發現病情加重，在此基礎上，研究者利用化學誘變使cp RSV進一步減毒，從而獲得一系列針對RSV A亞型的cps減毒活疫苗，其效果正在研究中。

一些鼻內給藥的減毒活疫苗在成年人和兒童身上都通過了Ⅰ期臨床試驗評估，其中一種（cpts248/404）還在1月齡兒童身上進行了評估[28]，這些嬰兒使用的cpts248/404疫苗雖已高度減毒，但還是引起一些嬰兒鼻塞，以致妨礙了嬰兒的飲食和睡眠，該結果提示cpts248/404疫苗對低齡兒而言沒有充分減毒，同時評估報告提供了在母傳抗體存在時RSV減毒活疫苗在復制和免疫原性、cpts疫苗表型穩定性等方面的重要信息。

研究者通過反向遺傳學設計了對RSV基因組的2個主要修飾：缺失M2-2基因，體外研究表明M2-2基因缺失導致病毒RNA復制減少，但同時通過轉錄增加F和G蛋白的表達，這意味著病毒充分減毒，但可能導致增強中和抗體反應[29]；或缺失NS2基因，已知NS2基因促進上皮細胞脫落，并抑制宿主細胞抗病毒Ⅰ型IFN誘導和應答[30]，因此缺失NS2基因可增強先天性免疫應答。候選疫苗RSV LIDΔM2-2于2016年6月至2017年7月進行了Ⅰ期臨床試驗，該疫苗作為鼻滴劑遞送至6～24個月的RSV血清反應陰性嬰兒，成功免疫受試者，但抗體滴度高于理想水平，因此該研究提前終止[28]。在此經驗基礎上，為了獲得比RSV LIDΔM2-2更減毒的突變株，研究者篩選出具有溫度敏感性的突變株LIDΔM2-2 1030s，并在6～24個月齡的血清陰性嬰兒中進行Ⅰ期安慰劑對照試驗。減毒活疫苗研究的另一個策略：缺失NS2基因的候選疫苗ΔNS2/Δ1313/1314L，具有遺傳穩定性和中等溫度敏感性，目前正在Ⅰ期安慰劑對照試驗中進行評估，該試驗在12～59個月齡的RSV血清陽性兒童和6～24個月齡的RSV血清陰性嬰兒中進行。

3.2 病毒載體疫苗

目前，RSV病毒載體疫苗侯選株多采用腺病毒作為載體，通過腺病毒表達F、N、M2-1或其他編碼免疫增強效應的非致病性病毒蛋白[31]，N和M2-1蛋白富含T細胞識別位點，可更好地激發針對RSV的特異性免疫應答[32]。與活病毒相似，載體疫苗能夠增加呼吸道黏膜的IgA抗體和細胞免疫反應，同時載體的佐劑性質可提高疫苗的免疫原性[33]。GlaxoSmithKline公司來源于黑猩猩腺病毒載體疫苗ChAd155-RSV（GSK3389245A）和GSK3003891A現已進行多項Ⅱ期臨床試驗，受試者為18～45歲和/或12～17個月的血清陽性的嬰兒。另一種由Janssen公司研發的來源于人腺病毒載體疫苗Ad26.RSV.preF（FA2）也正針對老年人及嬰幼兒進行臨床試驗，該侯選疫苗表達的pre-F蛋白進行了5個氨基酸位點的突變，具有一定的熱穩定性[34]，所進行的Ⅱ期臨床試驗于2017年11月開始，預計2019年3月結束，期望該候選疫苗能夠誘導出針對pre-F的高滴度中和抗體。

非復制型的安卡拉病毒（MVA）作為病毒載體在其他傳染病的疫苗研究中被廣泛使用，并已被證明其安全性[35]，現也應用于RSV疫苗的研究。Bavarian Nordic公司針對老年人的MVA-BN RSV候選疫苗就是采用MVA病毒載體，表達F、G蛋白（A、B亞型）及N、M2蛋白，已進入Ⅱ期臨床試驗。此侯選苗旨在誘導針對2種RSV亞型的保護性免疫應答，其研究結果表明：與接受安慰劑的受試者相比，在單次加強免疫接種后2周觀察到抗體顯著增強（2～4倍），包括針對RSV的中和抗體（IgG）及IgA抗體，在單次加強免疫接種后1周，在大多數受試者中觀察顯著T細胞應答（5～10倍）。同時，2種劑量水平下，疫苗均顯示出良好的耐受性和免疫原性。目前正在檢測Ⅱ期臨床接種后6個月的血液樣品，接受任一劑量單次疫苗接種的受試者將在今年晚些時候再次接種加強免疫，以觀察疫苗接種后12個月的免疫反應和再次強免疫接種的效果。

3.3 RSV亞單位疫苗

減毒活疫苗及載體疫苗對嬰兒最有希望，對于孕婦和老年人，這類人群不像嬰兒那樣易出現ERD，因此基于RSV蛋白的疫苗可能是最有效的候選疫苗。RSV中和抗體可從母體經胎盤轉移到胎兒，從而通過被動免疫對子宮內的胎兒進行免疫。因此，母體免疫可以增加經胎盤轉移的抗體水平[36]。此外，實驗研究結果顯示，妊娠期間RSV感染會改變后代的出生后免疫力和氣道高反應性[37]。這些發現進一步闡明了母體免疫在嬰兒期預防RSV感染和感染后遺癥的重要性。

RSV的F和G蛋白可以誘導中和性抗體及保護性抗體，已作為有希望的候選疫苗進行了評估。GlaxoSmithKline公司的亞單位疫苗RSV F（GSK3003891A）就是針對F蛋白的，其表達的可溶性分泌F蛋白主要是pre-F構象，Ⅰ期臨床試驗結果顯示具有一定的安全性和免疫原性[38]，然而，由于生產期間pre-F抗原的不穩定性，于2017年進行的Ⅱ期臨床試驗宣布停止。

Novavax公司的RSV F蛋白重組納米顆粒候選疫苗表達的是帶有部分氨基酸突變全長post-F蛋白，該疫苗顯示在豚鼠模型中能夠提高經胎盤傳遞的抗體，同時在18～35歲女性中無疫苗相關的不良反應，針對不同人群的疫苗已分別進入Ⅲ期及Ⅰ期臨床試驗。但2016年9月該公司宣布針對老年人的RSV F蛋白納米顆粒疫苗Ⅲ期臨床試驗失敗，原因主要是沒有達到預先指定的主要和次要療效指標，沒有證明疫苗的有效性。

另一種正在開發的亞單位候選疫苗RSV F DS-Cav1是利用結構生物學的方法對F蛋白進行改造，包括促進三聚體的穩定性、引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵，以及在空腔處填充疏水殘基等方式[39]，獲得穩定的pre-F構象。該疫苗能夠保留病毒表面F蛋白pre-F構象的中和敏感性表位，目前正在進行Ⅰ期臨床試驗[40]，評估RSV F DSCav1在孕婦及老年人群急性呼吸道患者中的安全性和免疫原性。

RSV中和抗體主要針對F蛋白的pre-F構象，但在生產或溶液儲存過程中pre-F構象很可能過早地重新形成穩定的post構象。MEDI-7510是由post構象的F蛋白與吡喃葡萄糖脂質A（一種合成的TLR-4激動劑）佐劑[41]構成的亞單位RSV疫苗，Ⅰ期臨床試驗研究評估了在60歲或以上人群中的安全性和免疫原性，結果顯示，接受MEDI-7510治療的受試者的免疫反應顯著高于安慰劑，疫苗的安全性與安慰劑相似[42]。Ⅱ期試驗于2016年11月終止，具體原因未說明。

4 結語

目前大部分RSV疫苗的研究主要針對F蛋白，由于Novavax公司的RSV F納米顆粒疫苗（post-F構象）Ⅲ期臨床試驗的失敗，使得人們將更多希望放在了pre-F構象的研究上。減毒活疫苗的開發要注意避免疫苗接種后引起的不良反應，以及避免因接種疫苗出現免疫反應不平衡而帶來的疾病，這些限制使得疫苗在減毒同時又保持適當的免疫原性非常困難。RSV病毒載體疫苗通過腺病毒、安卡拉病毒、新城疫病毒等病毒載體主要表達F蛋白或G蛋白，具有良好的前景，但大都處于開發的早期。而亞單位疫苗適合已經建立非致病性免疫反應的人群，但這種應答需要多次刺激，包括添加佐劑等，由于具有一定的安全性及免疫原性，亞單位疫苗被認為是最具有發展潛力的RSV候選疫苗。

數十年來，人們對RSV相關疾病帶來的社會經濟負擔有了越來越深的認識，使得更多的關注度落在其疫苗的開發上。盡管RSV疫苗的研究設計存在多重困難，諸如疫苗接種后可能會出現ERD；缺乏相關的免疫機理研究；面對不同目標人群，尚未有一致的臨床試驗終點等，但結構生物學等新方法和新技術的應用，為盡早闡明RSV的免疫保護機制提供了可能，拓寬了預防RSV感染的前景，前期臨床研究結果也為該領域的發展奠定了基礎，一批針對不同人群的疫苗候選株已進入臨床試驗，有望為RSV的防治做出貢獻。