長鏈非編碼RNA-重編碼調控因子與腫瘤的研究進展

周晉宇，柳杰，尹冶，輝紅蕾，王玉明

昆明醫科大學 第二附屬醫院 檢驗科，云南 昆明650000

癌癥是世界范圍內一個主要的公共衛生問題，也是美國第二大死亡原因。據美國癌癥協會2018年統計數據，美國將新增1 735 350例癌癥病例，609 640例將死于癌癥，亦即幾乎每天1700人死亡。最常見的癌癥死亡原因包括男性肺癌、前列腺癌和結直腸癌，女性肺癌、乳腺癌和結直腸癌。這4種癌癥占所有癌癥死亡的45%[1]。除此之外，各類腫瘤的發病率及死亡率出現逐年上升的趨勢，使對腫瘤發病原因和靶向治療的研究迫在眉睫。Hanahan和Weinberg[2]總結了人類腫瘤多級發展過程中形成的10個生物功能，構成了癌癥的特征，這些特征為分析復雜的腫瘤性疾病提供了一個組織原則。這10個特征包括：持續的增殖信號；避開生長抑制；逃避免疫破壞；無限增殖；促腫瘤炎癥；激活浸潤和轉移；誘導血管生成；基因組的不穩定和突變；抵抗細胞死亡；重構能量代謝體系。研究癌癥發現機理30年來取得了顯著進步，其碩果之一就是通過人類基因組測序可以部分揭示致癌基因在疾病發生發展中所起的作用。人類基因組測序結果顯示，具有編碼蛋白質功能的基因不到全部基因組序列的2%，而在占據人類基因組98%以上的非蛋白編碼序列中，絕大多數為長鏈非編碼RNA（long non-cod?ing RNA，LncRNA）。隨著大量LncRNA的發現，人們的研究重點從編碼RNA轉移到LncRNA，并探討其在生物體內的作用機制。2010年發現了基因間長鏈非編碼RNA（large intergenic non-cod?ing RNA，LincRNA）-重編碼調控因子（regulator of reprogramming，ROR），它不僅能夠調控重編程過程，而且在癌癥發生、發展過程中也扮演重要角色。但是，目前已知功能的LncRNA并不多，對LincRNA-ROR的功能研究更少。為了更全面地揭示其在腫瘤發病過程中的作用，我們在此將對LincRNA-ROR的發現及其在癌癥及癌癥調控網絡中的重要作用做簡要綜述。

1 LincRNA-ROR簡介

LncRNA是一組廣泛存在于哺乳動物細胞中的轉錄長度超過200 nt的非編碼序列，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成，因其缺少有效開放讀框而很少編碼或不能編碼蛋白質[3]。研究表明，它們可以通過與微小RNA（microRNA，miRNA）中的mRNA應答元件結合，競爭性地海綿化miRNA，最終調控基因表達，從而發揮競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）的競爭作用[4]。有研究表明，LncRNA參與的生物學過程包括染色質重構、轉錄及轉錄后調節下游基因的表達、細胞間信號傳遞。更值得注意的是，LncRNA在細胞異常調節、誘導腫瘤發生中起關鍵作用[5]。

LincRNA-ROR是基因間LncRNA的一種，由4個外顯子組成，位于染色體18q21.31，長2.6 kb。Loewer等[6]最初發現其在胚胎干細胞中參與細胞重編程過程，能夠調節分化細胞轉換為誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的重編過程，因此得名。近期研究表明，LincRNAROR是一種重新編程的調節劑，與腫瘤發生有關，在未分化的腫瘤中過表達，與腫瘤復發和不良的治療反應有很強的相關性。在結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌等組織及細胞中異常表達，且已證明與腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移等過程相關[7]。

據Loewer等[6]報道，LincRNA-ROR是多能干細胞重編程衍生的啟動子，是核心轉錄因子（tran?scription factors，TFs）Oct4、Sox2和Nanog的結合位點，被認為是調控這些TFs表達的一種ceRNA。LincRNA-ROR通過在轉錄后水平吸附miR-145，對人類胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）的自我更新和分化有巨大影響。此外有研究表明，LincRNA-ROR的表達水平限制在低分化細胞群中，與干細胞或具有干細胞樣功能的細胞相比，所有體細胞的LincRNA-ROR表達都較低，提示LincRNA-ROR的表達可能與干細胞樣特性有關[8]。

2 LincRNA-ROR的作用機制

LincRNA-ROR是一種典型的LncRNA，它在與miRNA的相互作用和維持干細胞多能性方面起著重要的調控作用，同時也可觸發上皮-間充質轉化（epi-to-mesenchymal transition，EMT）。LincRNA-ROR在缺氧條件下也發揮了各種關鍵作用，且對腫瘤的發生有著促進作用。Takahashi等[9]研究發現，LincRNA-ROR能夠在低氧環境中通過調節低氧誘導因子1α（hypoxia inducible fac?tor-1α，HIF-1α）及其下游基因來調控肝癌細胞的生長增殖。除此之外，雖然LincRNA-ROR主要促進腫瘤發生，但它部分通過阻斷KLF4的表達，也可以抑制腫瘤細胞增殖和膠質瘤干細胞（glio?ma stem cells，GSCs）自我更新[10]。

2.1 LincRNA-ROR作為ceRNA調節細胞進程

ceRNA通過與miRNA應答元件（miRNA re?spond elements，MREs）相互作用，在轉錄組的調控網絡中扮演重要角色。有研究表明，LncRNA在調控miRNA的濃度和生物學功能方面可能作為ceRNA發揮作用[11]，LincRNA-ROR也如此，其過表達可能逆轉miRNA與其靶基因之間的負調控。Wang等[7]在LincRNA-ROR與相關miRNA之間建立了一個調控反饋循環的模型，他們發現LincRNA-ROR作為ceRNA來調控包括Oct4、Sox2和Nanog在內的TFs的表達，以及通過分子海綿吸附hESCs中差異相關的miRNA來調控同源域蛋白，特別是miR-145。這些TFs已被證實在各種腫瘤中表達，并與未分化表型相關。通過外源性方式將TFs導入小鼠或成人細胞中，并將其重新編程為iPSCs，從而誘導多能性。此外，LincRNAROR不僅對多能細胞有影響，對癌癥干細胞（can?cer stem cells，CSCs）也有影響，敲低LincRNAROR可以降低CSCs成為癌癥起源的可能性，從而促進相關研究和細胞治療。在以上研究基礎上，Gao等[12]指出沉默LincRNA-ROR可以抑制胰腺癌干細胞（pancreatic cancer stem cells，PCSCs）的增殖、侵襲和致癌性，從而降低PCSCs的惡性特征。因此LincRNA-ROR可以作為胰腺癌的預后判斷因子。此外，有研究已經證實，在三陰性乳腺癌中，LincRNA-ROR的功能與ceRNA類似，它會海綿化miR-145，從而上調ARF6的表達。ARF6通過E-鈣黏蛋白調控乳腺腫瘤細胞的黏附和侵襲特性。值得注意的是，Duru等[13]認為來自CD49f+/CD44+/CD24-單細胞的侵襲性克隆激活Oct4/Sox2/LincRNA-ROR信號軸，從而維持癌癥干細胞的自我更新，并調節乳腺癌的分化。另外，LincRNAROR被確認為預后判斷生物標志物，并與miR-145相關，在結腸癌中發揮作用[14]。Zou等[15-16]研究表明，LincRNA-ROR可以作為分子海綿，競爭性地通過miR-145調控Sox2的表達，從而維持人類羊膜上皮細胞（HuAECs）多能性和提高它們分化成胰島β細胞的效率，這已被移植到糖尿病患者或動物模型證明它們可以幫助恢復胰島功能，因此有可能是潛在的治療方法。此外，有證據表明，LincRNA-ROR通過類ceRNA功能抑制miR-133的表達和功能，從而促進了胎兒基因（ANP和BNP）和心肌細胞肥大相關基因的再表達[17]。Lin?cRNA-ROR通過抑制miRNAs，在發育和組織再生過程中調控遺傳網絡，并有可能成為許多疾病的新療法。

2.2 LincRNA-ROR觸發EMT進程

EMT是上皮細胞失去細胞極性和細胞黏附，獲得遷移和侵襲特性，成為間充質干細胞的過程。LincRNA-ROR在上皮腫瘤發生中的作用涉及EMT觸發和干細胞獲得，抑制LincRNA-ROR可能逆轉EMT過程[18]。LincRNA-ROR可以阻止miR-205靶基因的降解，從而誘導EMT，促進乳腺癌的進展和轉移。此外，Chen等[19]發現，過表達的LincRNA-ROR能夠降低乳腺癌細胞系對抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的敏感性。通過誘導與5-FU和紫杉醇耐藥相關的EMT，證實了LincRNA-ROR是乳腺癌多重耐藥的重要標志。此外，LincRNA-ROR能夠通過上調E盒結合鋅指蛋白（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）而誘導啟動EMT程序，維持胰腺癌的干性，從而能夠促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移[20]。

2.3 LincRNA-ROR誘騙基因特異性組蛋白甲基化促進腫瘤發生

組蛋白經過翻譯后修飾，改變了其與DNA和核蛋白的相互作用，這些修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、亞酰化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。組蛋白修飾影響基因調控、DNA修復、染色體濃縮和精子形成等生物過程。Fan等[21]首先報道了LincRNA-ROR作為誘騙oncoRNA阻止染色質調節因子（G9A甲基轉移酶）的招募行為，進一步消除組蛋白H3K9修飾的啟動子TESC，并誘導異常的腫瘤生長和轉移。而在沒有Lin?cRNA-ROR表達的情況下，G9A甲基轉移酶恢復到TESC啟動子，從而通過靶向組蛋白H3K9甲基化沉默TESC的表達，顯著抑制腫瘤進展。此研究結果揭示了在腫瘤發生中LincRNA-ROR作為誘騙oncoRNA與組蛋白修飾的全新機制。

3 LincRNA-ROR與癌癥

3.1 LincRNA-ROR與結直腸癌（colorectal can?cer，CRC）

CRC是最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預后差，在全球癌癥相關死亡人數中排名第三，每年死亡人數約有69萬[22]。Li等[23]研究發現，CRC組織中LincRNA-ROR表達水平比相鄰組織明顯升高，敲減LincRNA-ROR能顯著降低HT29細胞增殖、觸發細胞周期阻滯、增強細胞凋亡，而LincRNA-ROR過表達對M5細胞系有顯著的相反作用。此外，研究發現LincRNA-ROR下調可抑制CRC細胞的生長和增殖。因此，認為LincRNAROR可能在CRC中作為一種促癌基因發揮作用。此外，在CRC中敲減LincRNA-ROR能顯著增加p53及其靶基因的蛋白表達水平，而Linc-ROR過表達則相反。p53蛋白水平與體內LincRNA-ROR呈負相關。這些數據表明，在CRC發生和發展中，LincRNA-ROR的機制可能部分通過p53的信號通路起作用。綜上所述，LincRNA-ROR有可能成為CRC的一種創新性和前瞻性的治療靶點。

3.2 LincRNA-ROR與胰腺癌

胰腺癌是惡性率最高的腫瘤之一，死亡率極高。Gao等[12]發現胰腺癌組織中的LincRNA-ROR明顯上調，且與腫瘤大小有關。此外，LincRNAROR表達水平較低的患者的總生存時間明顯長于中等或較強LincRNA-ROR表達的患者。通過RNA干擾敲減LincRNA-ROR可抑制PCSCs的增殖，誘導細胞凋亡，減少遷移。裸鼠實驗表明，LincRNA-ROR沉默導致PCSCs的腫瘤發生率顯著低于對照組。致癌機制研究發現，LincRNAROR可能作為ceRNA發揮作用，其通過干擾miR-145的功能而激活核心轉錄因子Nanog的表達。Nanog和LincRNA-ROR的表達都與PCSCs中的miR-145水平呈負相關，抑制LincRNA-ROR的表達能促進內源性miR-145上調及沉默Nanog的表達。LincRNA-ROR、miR-145和Nanog之間的上述關系可以定義為相互競爭、相互制約，平衡這種“LincRNA-ROR-miR-145-Nanog”關系是PCSCs維持其高增殖、侵襲和腫瘤發生率的重要機制之一。總之，在胰腺癌中LincRNA-ROR低表達可以抑制細胞增殖、侵襲和腫瘤發生，LincRNA-ROR在調控多重致癌性和胰腺癌進展方面發揮著直接作用。因此，LincRNA-ROR是預測胰腺癌患者術后臨床結果的一種新的預后標志物，也可能是治療的合理靶點。

3.3 LincRNA-ROR與乳腺癌（breast cancer，BC）

BC是最常見的癌癥類型，也是女性癌癥相關死亡的第二大原因，全球每年約100萬新增病例，超過40萬人死亡。Hou等[18]發現LincRNA-ROR可能是EMT的重要調控因子，通過調控miRNA表達，促進乳腺癌進展和轉移。該研究表明乳腺腫瘤標本中LincRNA-ROR上調，且能增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲。相反，沉默的LincRNA-ROR抑制乳腺腫瘤生長和體內肺轉移。LincRNA-ROR作為miR-205的ceRNA，通過抑制miR-205的表達而降低其對靶基因ZEB1和ZEB2的抑制作用，進而促進EMT的過程。因此，LincRNA-ROR作為EMT的重要調節因子，可以通過調控miRNAs促進乳腺癌的進展和轉移。同時提示LincRNAROR可能是侵襲性和轉移性乳腺癌的治療靶點。

Wan等[24]研究發現LincRNA-ROR可以作為一種誘餌oncoRNA來促進雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌的雌激素獨立生長。在雌激素缺乏的情況下，LincRNA-ROR會導致磷酸化MAPK/ERK通路的上調，進而激活ER信號。當LincRNA-ROR敲除后，雌激素缺失誘導的ERK激活和ER磷酸化消失，而LincRNA-ROR的重新表達可恢復上述所有表型。此外，還發現雙特異性磷酸酶7（DUSP7）參與了LincRNA-ROR敲除誘導的MAPK/ERK信號抑制。LincRNA-ROR敲除增加了DUSP7的蛋白穩定性，抑制ERK磷酸化。臨床數據分析顯示，ER陽性乳腺癌樣品中DUSP7表達低于ER陰性乳腺癌，且DUSP7表達下調與患者生存狀況不佳有關。

3.4 LincRNA-ROR與三陰性乳腺癌（triple-nega?tive breast cancer，TNBC）

TNBC約占BC病例的20%，特別是在年輕女性中經常發生。臨床上常常通過全身性治療來降低TNBC的特異性死亡率，但其復發率和轉移率仍然高，這意味著急需開發有效的治療方法。Eades等[25]研究發現LincRNA-ROR在TNBC細胞系和組織樣品中上調，其作為miR-145的ceRNA過表達，并下調miR-145的表達，進而調控三磷酸鳥苷（GTP）結合蛋白ARF6的表達，影響腫瘤細胞的黏附和轉移。miR-145下調是TNBC的一個標志，miR-145并不影響增殖或凋亡，而是調控腫瘤細胞的侵襲，且對參與腫瘤侵襲的miR-145調控通路的研究發現了一個新的靶點GTP結合蛋白ARF6。ARF6是一個已知的乳腺腫瘤細胞侵襲的調節因子，在TNBC和BC轉移中被顯著上調。ARF6的過表達導致E-鈣黏蛋白定位丟失，細胞連接中斷。這些研究結果揭示了LincRNA-ROR/miR-145/ARF6通路調控TNBC的侵襲。

Ma等[26]發現LincRNA-ROR/miR-145與TNBC細胞系MDA-MB-231中的靶基因MUC1相關。Mucin1（MUC1）是黏蛋白（mucin）家族的一員，通常在腺器官中表達。在乳腺癌中，MUC1通過誘導EMT增強癌細胞的侵襲性，其表達增加與淋巴結轉移和預后較差有關[27-28]。據研究，LincRNAROR的異常表達會增加MDA-MB-231細胞的侵襲轉移和功能喪失。LincRNA-ROR作為ceRNA作用于miR-145，上調MUC1的表達且影響E-鈣黏蛋白膜的定位，進而誘導EMT增強癌細胞的侵襲性。綜上，LincRNA-ROR/miR-145參與調控TNBC細胞侵襲和遷移的靶基因MUC1，提示Lin?cRNA-ROR可能是TNBC潛在的治療靶點。

4 結語

本文初步探討了LincRNA-ROR在癌組織中的異常表達，及其在癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學功能中的重要調節作用。許多證據表明，LincRNA-ROR是一種有效的腫瘤啟動子，在不同的癌癥中存在異常的表達。其腫瘤促進功能可歸因于其調控的靶基因涉及多種途徑，包括增殖、侵襲、血管生成和癌癥干細胞。LincRNAROR與許多信號通路密切相關，因此，要全面了解LincRNA-ROR的生物學作用，還需要發現新的靶點。LincRNA-ROR與腫瘤的惡性生物學行為明顯相關，這為進一步篩選腫瘤分子標志物奠定了基礎，同時也為腫瘤尋找分子治療靶標提供了依據。然而，有關LincRNA-ROR在腫瘤發生、發展中的分子調控機制，有待進一步深入研究。

LincRNA-ROR在眾多腫瘤中異常表達，可作為一些腫瘤早期篩查診斷依據。通過RNA干擾等實驗技術影響其在腫瘤組織中的表達，從而引起腫瘤細胞增殖、分化、轉移、凋亡等生物學行為以及對化療藥物敏感性的改變，為腫瘤的靶向治療及療效評估提供新思路。目前對LincRNAROR的研究尚處于初級階段，其作用機制等尚不明確。隨著研究的深入，相信LincRNA-ROR在腫瘤診斷、治療及預后中將發揮重要作用。