高效液相色譜電化學發光法檢測抗壞血酸的效果研究

朱碧寧

(陽江職業技術學院，廣東 陽江 529566)

引 言

抗壞血酸又稱為維生素C是一種已糖醛基酸，廣泛地存在于植物的組織中。抗壞血酸也是一種含有六個碳原子的酸性的多羥基化合物，具有很強的還原性，極易被氧化，被廣泛地運用于藥物、臨床治療、食品以及人體中，是人體中最不可缺少的一種重要的營養物質。抗壞血酸參與了人體內的一系列的代謝及其相關的反應，有利于刺激腎上腺激素的合成，促進了人體的腸道內的吸收以及解毒的作用。常用的測定的抗壞血酸的方法有很多，各種方法均具有自己的獨特之處，但是這些方法在樣品處理方面比較復雜，所以本文就在恒電流的條件下，利用不穩定的化學發光的試劑直接將抗壞血酸氧化使其產生化學發光并結合高效液相色譜法與電化學發光法，建立了高效液相色譜電化學發光法來檢測抗壞血酸。

1 高效液相色譜法以及電化學發光法的原理

第一，高效液相色譜法的原理。高效液相色譜(HPLC)法的原理就是將高壓下的液體作為流動相，并且采用顆粒極其細的高效固定相的柱色譜分離技術。高效液相色譜法具體的分為分析以及分離[1]。高效液相色譜法的分析原理：高效液相色譜法的分析是利用泵將相關的溶劑吸入到色譜系統中將溶劑吸入進去之后，再將溶劑輸出來，經過相關的測量之后，再通過色譜注，進行完分離之后，再次進入到檢測器，進行相關的信息采集以及處理，并同時記錄下。如果遇到了比較復雜的混合物(極性范圍比較寬的)那么就可以采用梯度控制器作為梯度來洗脫[2]。高效液相色譜法的分離原理：高效液相色譜法的分離，是在流動相以及固定相之間將進入色譜柱的溶質進行來回交換。其主要的原理就是因為溶質的不同分配系數或者是不同的分子大小，從而引起流動相以及固定相對溶質不同的阻力作用，這樣就使得不同的成分會因為不同的分配系數而以不同的速度流出色譜柱。比如，假設樣品中主要含有三種不同成分，A、B以及C，這三種成分進入了色譜柱之后(隨著流動相進入)，那些分配系數相對小的成分就會因為不容易被固定相固定住，而比較早地流出了色譜柱的外面。分配系數相對較大的則會在固定相中停留時間較長，會比較晚流出色譜柱[3]。而分配系數在兩者之間的則會第二個流出色譜柱。綜上所述，如果存在著這樣一種物質并進入到色譜柱中，會因為它里面的不同成分的不同分配系數，而呈現出不同的流動速率。這些成分就會以先后不同的順序流出色譜柱的外面，從而就會達到分離的目的。不同的組成成分在色譜柱中的分離的情況，最主要取決于各種的成分在兩相之間的分配系數、吸附的能力以及親和力是否存在著差異，這就是熱力學平衡的問題，同時也是分離的首要條件。其次就是當不同的組成成分在色譜柱中運動的時候，譜帶會隨著柱長而展寬，分離的情況和兩相(固定相、流動相)之間的擴散的系數、固定相顆粒度的大小、色譜柱的填充的情況以及與流動相的流動速度有關。所以分離的效果主要涉及到了熱力學與動力學兩種方面的綜合。

第二，電化學發光法的原理。電化學發光法是一種在電極的表面因為電化學反應而引發的特異性的發光反應，主要包括電化學以及化學發光兩部分。在電化學反應的過程中，給工作電極上的陽極加上一定量的電壓，在能量的作用下，陽極上就會釋放出電子從而發生了相關的氧化反應成為了更高價的金屬。在這個電極的表面的電子也會同時會釋放電子從而發生了相關的氧化反應，那么這個電子就會成為一種陽離子的自由基，迅速地自發脫去一個質子，形成另一個自由基。在整個的反應體系中就會存在一種極具有強氧化性的離子，以及極具有強還原性的自由基。這兩者之間還會發生氧化還原反應，最后的結果就會使高價的離子被還原成激發態的低價離子，能量的來源主要是在于高價的離子以及自由基之間所能夠形成的電勢差。通過這種循環的過程，測定的信號就會不斷被放大，靈敏度也就大大提高了。

2 高效液相色譜電化學發光法檢測抗壞血酸的檢測方法

第一，儀器與試劑的選擇。TCC-UV-260紫外線可見分光光度計、LC-6A高效液相色譜儀、C18柱、SPD-6AV紫外檢測器、超微弱發光分析儀、JH2C恒電位儀、電解池、抗壞血酸溶液(0.1 g/L)/MnSO4溶液(1 mol/L)、NH4H2PO4溶液(5.0 g/L)。所有的試劑都為分析純，所有的水都是二次去離子水。

第二，樣品的測定。在選定好的電化學的發光條件以及色譜的條件下，分別對人體的血清以及尿液中的抗壞血酸進行測定，將標準物質的流出的時間當作是定性的依據，然后再用峰高再對抗壞血酸進行定量檢測。取人體中的血清、尿液5 mL，分別加入到等體積30 g/L的H3PO4溶液中，當作是VC提取劑，用來防止蛋白質堵塞住了色譜柱，搖勻后靜置30 min，提取上層清液，將提取到的上層清液用0.45 μm的色譜過濾膜中過濾，最后再取30 μL進樣，這樣就用化學發光法檢測抗壞血酸得到了色譜圖。

第三，流動相的選擇。對于流動相的選擇應該與電化學發光的檢測相適應，所以選擇的流動相應該具有以下的條件：具有較好的分離的效果，而且又不能對電化學的試劑有影響(熄滅作用)。經過試驗發現5 g/L的NH4H2PO4溶液對于電化學的發光并沒有任何影響，并且具有無毒、價格便宜等優點。所以應選擇NH4H2PO4溶液作為流動相。

第四，流動相流速的選擇。流速對于發光強度有一定影響，流速在0.5 mL/min～2 mL/min的范圍內，電化學的發光的強度會隨著流速的增大而增大；但當流速大于2 mL/min的時候。電化學的發光強度會隨著流速的增大而減小，在考慮到要與高效液相色譜的泵速(1 mL/min)相匹配，而流動相的流速不一樣，對所呈現出的色譜峰的展寬也不一樣，所以在兼顧了靈敏度以及分離度的條件下，應選擇1.0 mL/min的流動相的流速。

第五，電解電流的選擇。電解電流也會對發光的強度有所影響，電化學的發光強度會隨著電解電流的增大而增大，但當電解的電流大于10 mA的時候，電化學的發光強度會隨著電解的電流的增大而減小。這是因為電極的表面會產生氣泡，從而影響穩定性，所以應選取電解電流應為10 mA。

第六，實驗的方法。在選定好的電化學發光的條件以及色譜的條件下，首先將輸液管插到相應的各個溶液中，然后啟動蠕動泵、恒電流泵以及高壓泵，等到基線穩定以后，用進樣器提取VC標準溶液或者是樣品溶液再注入到色譜柱中[4]。最后，根據色譜柱的峰高繪制出工作的曲線或者進行定量分析。

3 結語

高效液相色譜電化學發光法檢測抗壞血酸相比較于熒光法、分光光度分析法、色譜法等等，這種方法具有穩定性強、操作步驟簡單、靈敏度較高、選擇性好、準確性更高等優點。高效液相色譜電化學發光法檢測抗壞血酸也正在被廣泛應用，并取得了較大的進展。