微生物學技術在食品專業綜合實驗教學中的應用與實踐
——以“豬源大腸桿菌耐藥性調查研究”為例

蔣 晗，李佳瑤，方結紅，黃光榮，朱誠

（中國計量大學浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室，浙江杭州 310018）

0 引言

食品質量與安全專業自2002年招生至今，已在117所大學開設，分布在農、工、商、師、醫、水及綜合等各類高校。而食品質量與安全專業綜合實驗是本科生在學習了食品學科基礎課程、專業基礎課程和專業課程，具有了一定理論基礎、專業技能和科學思維后，所進行的實踐性教學環節，是培養學生實驗設計能力、實驗操作能力、問題總結能力和交流協調能力的一門側重點在“質量”與“安全”上的專業綜合實驗課程，也是食品質量與安全專業本科生的必修課[1]。

食品質量與安全專業綜合實驗是一門獨立成課的專業課程，它打破了傳統教學中實驗課程作為教學課程的補充與輔助模式，形成了“學習、實踐、創新相互促進”的實踐教學理念，這在提高教學質量、加強學生專業綜合能力和培養創新創業意識上起到了不可替代的作用[2-6]。

以學校食品質量與安全專業綜合實驗課題“豬源大腸桿菌耐藥性調查研究”為例，該課題由大四第一學期食品質量與安全專業本科生完成，由食品微生物技術方向指導教師進行指導。試驗采集杭州市農貿市場和超市新鮮豬肉樣本，利用選擇性培養基和特異性基因uidA分離鑒定大腸桿菌，利用K-B法藥敏試驗檢測其對抗生素的耐藥性，并利用PCR法進一步分析耐藥大腸桿菌攜帶耐藥基因的情況。這是一個半開放實驗，豬肉樣品和大腸桿菌篩選是固定內容，而耐藥性研究是開放的，可由學生就自己查閱的文獻或感興趣的內容進行深入研究。以下就是其中一組學生經指導教師指導后，形成的試驗方法與結果分析案例。

1 試驗方法與結果

1.1 方法

1.1.1 樣品采集與前處理

樣品采集自浙江省某地區的20家農貿市場和20家超市，每家農貿市場或超市各選5個攤位，分別購買生鮮豬肉1份（約100 g），農貿市場和超市樣品總計各100份。每份生鮮豬肉獨立放置于無菌保鮮袋中，記錄采樣地點和采樣時間后藏于冰盒，迅速低溫保存運回實驗室。運回實驗室后，立即在超凈工作臺用滅菌剪刀剪取25 g樣品，放入無菌袋內，向無菌袋內加入225 mL無菌蛋白胨水，用均質器高速均質2 min，充分混勻，收集上清液約10 mL裝入15 mL無菌離心管于4℃下冷藏備用。

1.1.2 大腸桿菌的分離和鑒定

大腸桿菌的分離方法參照GB 4789.38—2012食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數。大腸桿菌的分子鑒定方法驟如下：在NCBI網站下載大腸桿菌特異基因序列 uidA（GenBank ID：S69414），并利用primer premier 5.0軟件設計特異性引物：uidAF：5’-GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAA-3'； uidAR：5'-GGGATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGT-3'。引物由上海生工合成。PCR反應體系（25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10μmol/L），模板 DNA 2.0μL（250ng/μL），Premix Taq12.5μL，加ddH2O至25.0μL。PCR反應條件：94℃預變性1 min，98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃延伸10 min。取PCR反應產物5μL，于1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴增結果。

1.1.3 藥敏試驗

根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的 K-B紙片擴散法進行藥敏實驗，篩選對氯霉素類的氯霉素、氨基糖苷類的慶大霉素、磺胺類的復方新諾明、四環素類的四環素、喹諾酮類的環丙沙星、β-內酰胺類的頭孢西丁等抗生素具有耐藥性的大腸桿菌。根據藥敏試驗結果，測量抑菌圈直徑大小，比對NCCLS標準，分別判斷該菌為耐藥（R）、中介（I）或敏感（S）。

1.1.4 四環素類耐藥基因tetA的檢測

利用試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA，用primer premier 5.0軟件設計tetA特異性引物：tetAF：5'-GGCACCGAATGCGTAGAT-3'；tetAR：5'-AAGCG AGCGGGTTGAGAG-3'。引物由上海生工合成。PCR反應體系 （25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10 μmol/L）， 模 板 DNA 2.0 μL（250 ng/μL），Premix Taq 12.5μL，加ddH2O至 25.0μL。PCR反應條件：94℃預變性1 min，98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃延伸5 min。取PCR反應產物5μL，于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴增結果。

1.2 結果與分析

1.2.1 大腸桿菌的分離和鑒定

通過伊紅美藍培養基從100份農貿市場生鮮豬肉樣品中分離到大腸桿菌100株（每份樣品計分離株1株），未從超市生鮮豬肉樣品中分離到大腸桿菌。選用大腸桿菌特異性基因uidA為擴增對象，對疑似菌株進行PCR鑒定，標準菌株作為陽性對照，ddH2O作陰性對照，大腸桿菌特異性條帶為424 bp。經PCR鑒定，100株農貿市場生鮮豬肉源大腸桿菌疑似菌株均出現特異性條帶，陽性檢出率達到100%。

大腸桿菌分離鑒定見圖1。

圖1 大腸桿菌分離鑒定

1.2.2 大腸桿菌耐藥情況分析

豬源大腸桿菌分離株藥敏分析見表1。

由表1可知，①農貿市場樣品中大腸桿菌對于慶大霉素、氯霉素、復方新諾明、四環素、頭孢西丁、環丙沙星6種抗生素耐藥率分別為5%，52%，14%，100%，5%，19%；②分析結果表明，農貿市場來源的大腸桿菌對四環素的耐藥率顯著高于對頭孢西丁、環丙沙星、氯霉素、復方新諾明和慶大霉素等5種抗生素的耐藥率（p＜0.05）；③多重耐藥率達到59%，表明豬源大腸桿菌的多重耐藥性已經成為普遍現象。

表1 豬源大腸桿菌分離株藥敏分析

大腸桿菌K-B藥敏試驗示意圖見圖2。

圖2 大腸桿菌K-B藥敏試驗示意圖

1.2.3 四環素類耐藥基因型tetA檢測結果

利用PCR方法對大腸桿菌四環素類耐藥基因tetA的攜帶情況進行分析，結果顯示大腸桿菌中tetA基因的檢出率達到65.00%（65/100），表明對四環素類抗生素產生耐藥性的大腸桿菌中大多富含tetA基因。

四環素類耐藥基因tetA凝膠電泳圖見圖3。

圖3 四環素類耐藥基因tetA凝膠電泳圖

2 試驗教學效果分析

通過綜合實驗的學習，學生能夠掌握微生物檢驗的國標方法，微生物分子生物學基本設計與操作、美國臨床和實驗室標準協會推薦的K-B紙片擴散法藥敏試驗等一系列重要的微生物學技術。對于大部分基礎性實驗采用計劃安排的方式，在規定時間由全班學生統一完成，如此次實驗的大腸桿菌分離鑒定工作。對于少部分綜合設計性實驗采用課堂教學和小組預約結合的方式，如豬肉采樣和前處理工作，由指導教師課堂教學采樣及前處理方式，再由每5～6位學生具體負責一個區域的采樣，并立即送回實驗室進行前處理工作，指導教師或研究生現場指導。對于研究創新性實驗采用學生個人預約的方式，如此次實驗的耐藥數據分析處理工作，可由每位學生根據自己感興趣的角度對大量數據進行分析，并撰寫論文，期間可預約指導教師進行探討。通過多種渠道投入，逐步形成理論教學與實踐教學相互協調的實踐新體系。

加強師生有效互動，在指導教師的幫助下，食品質量與安全專業本科生有更多機會鍛煉科學思維，提升科研能力。在綜合實驗學習過程中，以學生為主體，指導教師采用討論式教學和啟發式教學，起到引領方向和答疑解惑的作用，既有大課堂的理論教學，又有分組及點對點的討論，以多種形式啟發引導學生自主學習，獨立分析、思考、和解決問題。

最后，在雄厚的科研實力支撐下，將科研中的先進實驗方法與內容帶進實踐教學中，以實驗內容改革引導實驗技術開發，新型的實驗技術成果又反過來推動實驗內容的不斷完善。同時，安排高層次理論課教師擔當實踐教學、實驗項目開發和實驗室管理，既加強了理論教學、科學研究與實踐教學的結合，提高了實踐教學水平，又帶動和幫助實驗教師提高教學與科研水平，提高實踐教學質量。