功能材料在蛋白質組研究中的應用進展

相小超, 焦豐龍, 張養軍, 錢小紅, 秦偉捷

(軍事醫學研究院生命組學研究所, 北京蛋白質組研究中心, 國家蛋白質科學中心(北京) 蛋白質組學國家重點實驗室, 北京 102206)

蛋白質組學研究器官、組織或細胞內所有蛋白質及其動態變化規律,本質上是在大規模水平上、從整體角度研究蛋白質的特征、動態變化、表達水平、翻譯后修飾以及蛋白質與蛋白質的相互作用等的一門科學[1]。而從組學層面對蛋白質進行研究,仍受多種因素的限制,例如不同蛋白質表達量差異巨大、翻譯后修飾的官能團種類繁多、動態范圍廣及蛋白質本身的空間結構復雜等[2],因此,在表達譜的深度覆蓋、翻譯后修飾的準確鑒定及蛋白質組的定量等方面,現在的蛋白質組學技術還存在很多缺陷。為此,近年來,研究者們嘗試將各種功能材料應用到蛋白質組學分析中,對樣品預處理的分離技術進行優化,從而達到高靈敏度鑒定,高準確性分析,高通量表達,精確測量生物樣本中蛋白質表達量變化的目的。本文對功能材料的介紹主要從應用于蛋白質酶切的功能材料、用于轉錄因子富集的功能材料、用于翻譯后修飾蛋白質組研究的功能材料以及蛋白質組定量研究的功能材料這四個方面進行綜述,并對功能材料在蛋白質組學方法研究中的應用進展予以展望,可為功能材料在蛋白質組學方法研究中的應用提供參考。

1 功能材料在蛋白質酶切中的應用

目前,基于生物質譜的“bottom-up”研究策略是蛋白質組學研究的最常用手段,在此策略下,蛋白質先被酶切成肽段,再進行質譜分析,根據譜圖分析結果,對蛋白質進行定量定性分析[3]。因此,酶切是基于質譜蛋白質組分分析的關鍵步驟,而傳統溶液酶切時間較長、酶切效率低,并且存在自切現象,影響了蛋白質組學的深度覆蓋研究,而固定化酶技術由于可以大幅度提高酶解速度,增加酶活性和穩定性,避免蛋白酶自切片段的產生而改善譜圖質量,并可反復使用,得到了廣泛關注[4]。固定化酶是在一定的空間范圍內起催化作用,并能反復和連續使用的酶。在固定化酶技術中,載體材料上的活性基團、微環境、載體的形狀等因素,會影響載體與酶的親和力,影響固定化酶活力、穩定性、重復使用性及可回收性[5]。所以對載體材料的研究也變得至關重要。

磁性納米材料具有比表面積大、可增強酶活性和穩定性、磁響應性強、易在表面修飾多種功能基團等優點,是固定化酶常用的載體材料,用于蛋白質組學方法的研發中以應對蛋白質組研究面臨的各種挑戰[6]。酶切是蛋白質分析方法中的關鍵步驟之一,為了解決蛋白質組分析中快速、完全酶切的問題,楊屹課題組[7]建立了一種新型固定化酶反應器,利用磁性納米粒子作為固定化酶載體,通過DNA定向固定化技術成功地固定堿性磷酸酶(ALP),并利用DNA鏈置換反應將胰蛋白酶(trypsin)在溫和條件下置換ALP,從而將胰蛋白酶固定化,實現了酶的替換。實驗表明,該固定化酶反應器具有較好的選擇性和較高的酶切效率,重復使用10次仍可保持原酶活性的86%。該反應器具有高磁響應性,便于回收固定酶和重復使用,節約實驗成本,可將其廣泛應用于各種酶促反應中。呂永琴等[8]制備了一種可重復使用的酶固定化載體AuNP@Fe3O4納米顆粒,該載體由涂覆一層金納米顆粒(AuP)的磁性Fe3O4納米顆粒組成,金納米顆粒充當中間配體,然后將胰蛋白酶可逆地固定在該載體上。實驗結果表明,基于該載體材料的固定化胰蛋白酶反應器可以在15 min內實現標準蛋白質的完全酶切,還可以在蛋白質酶切后,利用磁鐵對納米材料進行回收重復使用。李笑迎等[9,10]還利用孔徑介于2～50 nm的一類介孔材料具有較高的載酶量、較大的比表面積、可調節孔徑、良好的化學穩定性等優點,對其在固定脂肪酶中的應用進行了研究,他們先以三乙烯四胺為固化劑,在聚乙二醇介質中通過環氧樹脂聚合反應誘導相分離制備出環氧樹脂大孔聚合物,再以制備好的環氧樹脂大孔聚合物為模板,制得了毫米級尺寸的大孔/介孔多級孔SiO2材料。這種材料是由連續SiO2納米薄膜構建的,不僅具有三維連續貫通的大孔孔道,而且孔壁上存在大量介孔,能有效提高酶活性,增加載酶量,能使固定化酶易從體系中分離和重復使用,操作過程簡單且固定化成本降低,是固定化酶的優良載體。Singer等[11]制備了具有大孔的功能化介孔二氧化硅納米粒子材料(LP-MSN),并通過銅催化的1,3-偶極環加成反應,將兩種不同的乙炔功能化酶(sp-碳酸酐酶和sp-辣根過氧化物酶)固定在獲得的LP-MSN材料的孔中。合成的LP-MSN尺寸范圍約為100 nm,有大至12 nm的孔徑,成為活躍的、穩定的、可重復使用的酶-二氧化硅系統,可在幾個循環的活性測定期間中保持高活性。錢小紅課題組[12]利用溫敏聚合物對外界溫度具有響應能力的性能,制備了一種新型的基于可溶性溫敏聚合物的固定化胰酶反應器,即將N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)作為溫度響應基團,合成了具有最高臨界溶解溫度響應能力的N-丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛(poly(NAGA-co-UnAl))溫敏聚合物,再將該溫敏聚合物作為載體材料,制備得到新型可溶性溫敏固定化胰蛋白酶。他們又通過控制反應體系溫度使固定化酶對蛋白質樣本實現了酶解和分離,有效解決了固定化蛋白酶酶解時存在的固液界面傳質阻力和空間位阻的問題,縮短了酶解時間,提高了酶解效率,實驗結果證明該材料在固定化酶技術應用中具有潛力。

功能材料在蛋白質酶切過程中的應用實例說明隨著各具特色新型載體的出現,將借此制備出各種高效固定化酶反應器,為蛋白質組深度覆蓋及定量分析發揮作用。

2 功能材料在轉錄因子富集中的應用

轉錄因子(transcription factor, TF)作為一種具有特殊結構,能行使調控基因表達功能的蛋白質分子,在蛋白質表達中起著至關重要的作用。但是目前的技術手段仍不能有效得到深度覆蓋轉錄因子。將功能材料用于轉錄因子富集中,發展高效、高特異性的轉錄因子富集技術,對蛋白質組學、基因組學和轉錄組學的研究至關重要。為此,謝輝等[13]為了解決轉錄因子豐度低、難以直接進行質譜鑒定的問題,基于磁性功能材料和效應元件設計了可以高效富集肺癌組織的轉錄因子富集技術(TFRE)。他們利用轉錄因子能與序列特異性DNA元件結合的特點,合成了含有大多數轉錄因子結合位點的DNA序列,并將此序列鍵合在載體上,然后在體外擴增生物素標記的PCR引物,從而得到生物素標記的DNA序列。再以生物素和親和素之間的獨特結合特性為基礎,將“DNA誘餌”偶聯到鏈霉親和素標記的磁珠上,然后再與預先制備好的組織核蛋白一起孵育,得到DNA-蛋白復合物,再經電泳和膠內酶解之后進行質譜鑒定。實驗結果表明TFRE技術可以高效地對肺癌組織中的轉錄因子進行富集。謝輝等[14-16]還開發了一種高靈敏度、高選擇性、高通量等優點的TOT(TFRE on Tip)技術,可用于富集鑒定內源性TFs。這種技術是將級聯串聯轉錄因子效應元件(catTFRE)作為親核試劑富集轉錄因子,規模化定量內源性TFs,解決了catTFRE單獨應用存在的問題,能更高效、更精確、高通量地反映信號變化。實驗結果表明,TOT技術可從微量樣本中篩選TFs,達到高效富集內源性TFs的目的,在細胞信號轉導等功能研究中起到關鍵作用。這些應用實例表明功能材料在生物學研究中可發揮獨特作用。

3 功能化材料在翻譯后修飾蛋白質組研究中的應用

蛋白質翻譯后修飾(PTMs)是通過對蛋白質側鏈和末端進行化學修飾或者是被蛋白水解酶酶切來改變蛋白質性質的共價加工過程[17]。PTMs包括磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化、類泛素化等多種修飾[18]。PTMs可以通過調節蛋白質的活性、親疏水性、穩定性和空間結構,從而影響蛋白質的功能,最終改變細胞的表型特征和生物學功能,參與調節機體的許多生命活動,如基因表達、細胞分化與凋亡、信號轉導等,也與多種腫瘤的發展密切相關[19]。但大多數發生翻譯后修飾的蛋白質通常具有豐度低、動態范圍寬以及結構復雜等特點,因此對蛋白質翻譯后修飾進行規模化分析面臨著巨大的挑戰。對復雜生物樣品中翻譯后修飾蛋白質和肽段進行選擇性富集,是實現翻譯后修飾蛋白質組學規模化分析鑒定的關鍵步驟。

蛋白質磷酸化修飾是一種非常重要的蛋白質翻譯后修飾,蛋白質通過磷酸化修飾可以調控蛋白質的生物活性、影響信號傳遞過程[20]。但由于磷酸化修飾蛋白質豐度低、動態范圍廣,且酶解后磷酸化肽段離子化效率低,使得直接對磷酸化修飾蛋白質酶切樣品進行質譜分析變得十分困難,需要對樣品中的磷酸化肽段進行選擇性的富集[21]。目前有許多方法應用于磷酸化肽段富集,如固相萃取/固相微萃取、金屬氧化物親和色譜、固定金屬離子親和色譜、離子交換色譜、基于抗原-抗體相互作用的免疫親和富集方法等,但這些常用的方法存在磷酸肽富集特異性差、材料與溶液分離不完全、樣品損失、富集操作繁瑣、耗時長等不足,為了解決這些不足,研究者們不斷設計和制備新型富集材料,尋找具有更好富集特性的功能富集材料[22]。

金屬氧化物色譜法(MOAC)是磷酸肽富集的一種常用方法。近年來,多種金屬氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被用于磷酸肽的選擇性富集。二氧化鈦是目前較為成熟的金屬氧化物富集材料。錢小紅課題組[21]構建了TiO2串聯反相填料的離心式富集裝置,結合抗體免疫沉淀,將磷酸肽的富集和分離有機結合。通過用自制的TiO2和反相填料裝填小柱將磷酸肽從復雜樣品中分離出來,并將富集產物分離成不同餾分,降低了體系的復雜程度,再通過抗體特異性地富集酪氨酸磷酸肽,提高了富集的選擇性,減少了樣品的損失和人力物力的損耗。

研究人員還發現基于多金屬氧酸鹽(POM)的磁性材料在蛋白質吸附方面具有較大的應用潛力。POM是過渡金屬離子的高氧化態(如釩(V)、鉬(Mo)、鎢(W)等)與氧形成的納米級金屬-氧簇類化合物。基于POM具有豐富的化學位點和顯著的金屬氧化物表面特征,賈瓊等[23]制備了多金屬氧酸鹽/殼聚糖磁性復合材料,再結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)檢測手段,用于對磷酸肽的檢測分析。實驗通過對β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能考察表明,這種磁性復合材料可以有效地對磷酸化肽進行富集,避免非磷酸化肽段的影響。馮鈺锜等[24]也對金屬氧化物材料進行研究改進,采用液相沉積法制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維(ZrO2-CF)材料,對材料表征,并將其應用于磷酸化多肽的選擇性富集。實驗結果表明,脫脂牛奶酶解物經過ZrO2-CF富集后,非磷酸化多肽被有效去除,有9個磷酸化多肽被檢測到,較直接用基質輔助激光解析電離飛行時間(MALDI-TOF/TOF)質譜分析(檢測到6個磷酸化多肽),質譜信號更強,靈敏性更高。

固定金屬親和色譜(IMAC)是目前廣泛應用的一種磷酸肽富集方法,其原理是帶正電的金屬離子與帶負電的磷酸基團發生相互作用而結合[25]。制備IMAC的核心是螯合金屬離子的基質材料制備,根據基質材料性質不同可分為納米材料、微球色譜基質、棉纖維、分子印跡材料、整體材料、共價有機骨架材料等[26]。馮鈺锜等[27]選擇表面有大量羥基的棉花作為材料進行功能化修飾,在棉花的纖維表面修飾聚多巴胺(PDA),然后利用兒茶酚羥基固定Ti4+,設計合成了一種固定金屬親和色譜(IMAC)材料Cotton@PDA-Ti4+。該材料具有良好的生物相容性,機械性能穩定,化學性能穩定,實驗結果表明,Cotton@PDA-Ti4+可以有效地將磷酸化多肽從非磷酸化多肽的體系中分離出來,有較高的富集效率。Dai等[28]還將DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷四乙酸)作為螯合配體涂覆在TiO2納米材料表面,螯合鋯離子Zr4+,形成了新的IMAC材料TiO2@DOTA-Zr。該材料具有較大的比表面積和較強的親和力位點,同時DOTA與Zr4+之間極強的結合相互作用力增加了固定Zr4+的數目,有效減少了金屬離子的損失,增強了對磷酸肽的富集選擇性,成功應用于富集脫脂牛奶和人血清樣品的胰蛋白酶消化物中的磷酸肽。李嫣等[29]通過溶劑熱反應合成Fe3O4微球,再在表面上進行多巴胺的自聚合反應,通過利用PDA的羥基和氨基結合各種金屬離子(Ti4+、Nb5+、Zr4+、Ce4+、Ga3+、Y3+、In3+和Fe3+),成功合成了涂覆有各種金屬離子的Fe3O4@PDA微球。對磁性微球進行表征后,基于磷酸肽與金屬離子的結合親和力,對磷酸肽進行富集,實驗結果顯示,不同的金屬離子在選擇性、靈敏度和真實復雜樣品的富集能力方面表現不同,而Fe3O4@PDA-Nb5+和Fe3O4@PDA-Ti4+相較于其他離子具有更好的磷酸肽富集能力。王和平等[30]通過將鈦離子直接固定在富含TpPa-2COF的富氮骨架中,制備了鈦離子修飾的共價有機骨架材料TpPa-2-Ti4+,用于磷酸肽的特異性富集。該材料對于β-酪蛋白磷酸化多肽的檢測限低至4 fmol,提高了選擇性(β-casein∶bovine serum albumin (BSA)=1∶100, m/m),同時實現了對磷酸肽的高靈敏度、高選擇性的富集。

蛋白質糖基化修飾也是一種重要的翻譯后修飾,它以各種方式廣泛參與基本生物學過程,包括基因轉錄、基因表達、蛋白質翻譯調控、信號轉導、蛋白質降解、受體激活等[31]。由于糖肽豐度低、糖鏈結構復雜、糖基化位點的微觀不均一性、糖肽的離子化效率差以及肽段的質譜信號受到非糖肽的信號抑制,導致直接用質譜分析糖基化蛋白面臨許多挑戰[32]。因此質譜分析糖基化蛋白或糖肽前對復雜生物樣品中的糖蛋白或糖肽進行選擇性分離富集是成功鑒定糖蛋白或糖肽的關鍵。近年來,許多方法被應用于在復雜生物體系中選擇性的分離和富集糖蛋白或糖肽,主要有凝集素親和色譜法、肼化學法、硼酸化學法和親水相互作用色譜法等[33,34]。許多材料也被應用于糖蛋白或糖肽的富集和分離,主要有磁性微球[35]、磁性納米顆粒[36,37]、氧化石墨烯[38]、介孔材料[39]、金屬有機骨架材料(MOFs)、共價有機骨架材料(COFs)[40]等。

氧化石墨烯功能材料便是一例。氧化石墨烯是在石墨烯的基面和邊緣連接上大量含氧基團形成的,是一種性能優良的新型二維碳納米材料,具有較好的導電導熱性能、有較大的比表面積和表面豐富的含氧官能團,在糖肽富集中有較好的應用[41]。為了解決應用于凝集素富集的功能化材料存在負載量偏低以及富集效率有限等問題,錢小紅等[42]將麥胚凝集素(WGA)和伴刀豆凝集素A(Con-A)的自由氨基與GO(氧化石墨烯)表面的羧基通過偶聯反應鍵合在GO表面,成功合成了高負載量的氧化石墨烯固定化凝集素GO-WGA和GO-ConA(固載量>1.90 mg/mg)。這兩種固定化凝集素可以針對不同糖型的糖蛋白進行富集,而且材料制備容易,富集操作簡單,負載量高。蔣波等[43]通過在聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯表面負載金納米顆粒,然后通過形成Au-S鍵在表面固定4-巰基苯硼酸,合成了4-巰基苯硼酸功能化氧化石墨烯復合物(GO/PEI/Au/4-MPB復合材料),并將其用于糖肽的選擇性富集和分離。研究結果表明,該復合材料在N-糖肽的捕獲中顯示出高的選擇性和靈敏度,而且該材料具有較強的親水性,與胰蛋白酶BSA特異性結合,在復雜生物樣本中有較好的應用前景。該實驗室還使用聚乙烯亞胺作為還原劑和固定試劑,在磁性氧化石墨烯上鍵合金納米顆粒合成了親水性GO/Fe3O4/Au/PEG納米復合材料,然后通過硫醇末端聚乙二醇固定化實現對糖肽的高選擇性富集。該材料具有二維結構和優異的親水性,可以從人血清中鑒定出255種糖肽,證明了該材料在糖基化分析中的應用潛力[44]。

另外,磁性微球是一種新型的磁性功能材料,是通過適當方法將磁性無機粒子與有機高分子結合形成的具有一定磁性及特殊結構的復合微球。磁性微球具有可控的磁學性能、超順磁性、具有生物相容性、表面易被官能團修飾、材料簡單易獲得等優點,能實現樣本溶液與材料的快速分離,被廣泛應用于糖肽的富集[45]。鄧春暉等[46]將葡萄糖-6-磷酸作為官能化基團連接到Fe3O4磁性微球表面上,成功制備了親水性Fe3O4@G6P微球,并將其作為新型親水性探針,成功地選擇性富集了復雜生物樣品(人血清和人唾液)中的N-糖肽,實驗結果表明,該材料對于糖肽具有優異的富集性能,靈敏度高(0.5 fmol/μL),選擇性高(horseradish peroxidase (HRP)∶BSA=1∶100, m/m),重復性好(至少10倍),在基于MS策略的糖肽富集中有很好的應用前景。王富強等[47]通過將硼酸分子共價結合到硅烷化的Fe3O4@mTiO2微球表面上,制備得到了硼酸修飾的磁性Fe3O4@mTiO2微球,該材料B-Fe3O4@mTiO2同時具有超順磁性和介孔。而且為了提高材料的富集效率和使用效率,研究人員開發了一種將B-Fe3O4@mTiO2與聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)納米珠一起使用的協同方法,用于高度特異性和有效地富集N-糖肽/糖蛋白。富集糖肽結果表明,與單獨應用B-Fe3O4@mTiO2相比,協同方法可以檢測到更多數量的糖肽,信噪比顯著增加,靈敏度大大提高,而且測定糖肽的回收率高達92.1%。

金屬有機骨架(metal organic frameworks, MOFs)材料,也稱多孔配位聚合物,是一類以金屬離子為中心、有機物為配體的新型多孔骨架材料,由于具有多孔性、較大的比表面積、可設計的結構、可調的孔徑等優點,使得MOFs在糖肽的富集應用中有獨特的優勢[48]。基于此,張祥民等[49]利用外延生長策略成功制備了Fe3O4@Mg-MOF-74核-殼納米粒子,該材料具有一維通道結構、合適的孔徑、親水性和生物相容性等優點。使用該納米粒子進行富集后,在1 μL消化的人血清中,對應于125種糖蛋白和18種糖肽的441個N-糖基化位點可以被成功檢測到,證明材料具有高的富集效率和選擇性。白玉等[50]通過簡單常規的兩步方法合成了半胱氨酸功能化的金屬有機骨架,先將Au納米顆粒原位加載到氨基衍生的MOF上,然后再進行L-半胱氨酸固定。由于該納米復合材料具有較大的比表面積和超高親水性,在模型糖蛋白和Hela細胞裂解物中富集N-糖肽時表現優異。而且通過使用這種復合材料,從細胞裂解物中可以鑒定出對應于1 069個N-糖肽和614個N-糖蛋白的1 123個N-糖基化位點。結果證明,半胱氨酸功能化的金屬有機骨架材料結合能力大(150 mg/g, IgG消化至材料)、選擇性良好(IgG和BSA消化的摩爾比為1∶50)、回收率高(超過80%)和檢測限低(1 fmol),在糖肽富集中有很好的應用前景。

共價有機骨架材料(covalent organic frameworks, COFs)是由有機結構單元通過共價鍵形成微孔/介孔結構的一類新型高分子材料,由于具有大的比表面積、極低的骨架密度、可調的孔結構、良好的酸堿穩定性和熱穩定性等顯著優點,被廣泛應用于糖肽富集中[51]。錢小紅等[52]通過溶劑熱反應,在磁性納米粒子表面上原位生長TpPa-1共價有機骨架,構建具有超順磁性的海膽型復合材料Fe3O4@TpPa-1,將該材料用于親水富集時,可以分別從IgG和HRP消化物中檢測到37種和22種糖肽,可以從人血清消化物中檢測到對應于114種糖蛋白的228種糖肽,證明了這種新材料的富集效率高,檢測限低(28 fmol),在糖蛋白組學研究中有很好的應用。馬玉芳等[53]利用1,3,5-三甲基間苯三酚和對苯二胺的席夫堿反應合成TpPa-1共價有機骨架材料,并將其成功地用作N-糖肽富集的親水性多孔材料。這種材料對糖肽有很好的特異性和選擇性,可以有效消除非糖肽的干擾,有利于進行糖肽的質譜檢測。而且由于材料中具有強的共價鍵,該材料具有良好的穩定性,可以重復使用至少10次,在N-糖肽富集中有良好的應用前景。這些功能材料的成功應用進一步表明其在蛋白質組學研究中的應用潛力。

4 功能材料在蛋白質組定量研究中的應用

18O標記是目前廣泛應用的一種蛋白質定量標記方法,18O標記方法具有操作簡單、無副產物、條件溫和等優勢,但是也存在標記不完全、效率低、18O和16O發生反向交換、標記易丟失等問題[54]。為了解決這些問題,研究人員開始研究能在定量中輔助18O標記設計的功能材料。錢小紅等[55]將毛發狀非交聯聚合物鏈雜化磁性納米粒子作為基質,利用原子轉移自由基聚合技術,開發了一種新型的固定化胰蛋白酶,用于實現簡單快速的18O標記和蛋白質組定量。在他們的標記策略中,游離胰蛋白酶被PHMN-胰蛋白酶替代,其在標記僅1 min后就可以通過磁體方便地與標記的肽分離,實驗結果表明,兩種標準參考肽ENO-1和ENO-2具有兩個18O原子的完全標記,在3次試驗中的平均標記效率分別為96.7%和96.5%,并且未發生18O和16O的反向交換,該固定化胰蛋白酶成功實現了簡單快速的18O標記。這表明功能材料也可在定量蛋白質組研究中發揮作用。

5 結束語

對于功能材料在蛋白質組學中的應用的研究從未停止,由早期的單一材料發展到復合材料,從直接使用自然界中的已有材料到對已有材料進行改性和使用新型材料來有效提高蛋白質組的分析效率,改善分析方法選擇性、靈敏度和易操作性。盡管如此,為了功能材料能在蛋白質組學研究中發揮更好的作用,對功能材料的選擇應用,還需要綜合考慮多方面因素,包括功能材料的來源難易程度、理化性質、工藝成本和可修飾特點等。另外,隨著材料學和生物工程技術的發展,更多性能優良的功能材料將不斷被應用到蛋白質組學研究中,這不僅擴展了功能材料的應用范圍,也必將滿足蛋白質組學不斷提出的新挑戰、新問題,促進蛋白質組學研究邁向更高層次。