生物物證DNA污染的成因與預防

張飛，黎波

（新疆警察學院，新疆烏魯木齊 830000）

生物物證作為證據物證的一種，主要包括人源性生物物證和非人源性生物物證[1]。人源性物證主要包括骨片、毛發、組織塊、血痕等組織器官，精液（精斑）、唾液（唾液斑）、糞便、尿、羊水、嘔吐物等分泌物和排泄物，此外還有指紋、唇紋、咬痕、足跡（赤足）等。非人源性生物物證主要有動物、植物、昆蟲和微生物等物證，如某些動物的血液（痕）、體液（斑），某些植物的液汁或其斑痕及其提取物等，一些可用以推斷死后間隔時間和所到區域的昆蟲或土壤中含有的包括各種細菌、真菌在內的微生物等群體。

生物物證技術是在傳統法醫物證檢驗基礎上發展起來的一門新興學科，廣泛應用于刑事、民事案件的偵查檢驗、鑒定。該學科涉及生物化學、分子生物學、基因工程、法醫學、人類學等多門自然學科[2]。因此，生物物證在自然科學技術發展的基礎上，在刑事案件中對于人源性生物檢材的種屬認定起到關鍵性作用。隨著DNA提取技術以及二代測序技術的不斷完善，高通量測序在刑事案件人源性生物檢材的分析越來越受到重視[3-6]。然而，在實際生物物證DNA的提取和檢測過程中經常會發生檢材污染的問題，無論是勘查提取人員的污染還是分析檢驗人員的污染都不可避免，嚴重影響實驗結果。本文針對DNA樣品提取分析過程常見的污染進行分析討論，并提出可行性建議，以期減少檢驗過程的樣品污染。

1 生物物證DNA的污染

造成DNA實驗污染的因素主要分為外因和內因，外因主要有:（1）自然形成的污染，主要是生物檢材暴露在環境中受到雜物的污染；（2）勘察人員在發現、運輸、提取時造成的污染；（3）發生在物證流轉過程中導致的污染。內因主要有實驗室內使用試劑污染、氣溶膠污染、核心設備污染，此類污染發生在物證檢驗過程中，不易發現。

1.1 環境對生物檢材的污染

環境對生物檢材的污染是最普遍也是不可避免的，由于勘查人員勘查的是靜態的現場，是經過作案人干擾過或作案人處理過的現場，有很多的不確定因素在里面，例如掉在血泊中的煙蒂、帶血的手套、水中的衣物、拋棄在垃圾桶中的物證等等，這些生物檢材在檢測過程中都會受到周圍環境的污染和干擾。特別是微生物細胞，或少量的人體脫落細胞等的污染，研究結果顯示，至少20個口腔上皮細胞或30個精子細胞檢測運用Identifiler plus PCR試劑盒（美國AB公司）檢測，可以獲得全部分型。因此，越微量的物證越容易被污染。此類污染即使是微生物DNA片段在進行PCR擴增時也會被擴增出來無法去除，導致假陽性結果從而干擾分析。

1.2 生物檢材勘查提取過程造成的污染

現場勘察人員徒手提取物證，或使用未經過消毒滅菌的器具提取物證，以及未及時更換一次性手套、剪刀、鑷子等情況都容易使樣品污染，另外勘察人員使用吸附性較好棉手套提取造成的吸附性污染，現場物證在運輸時使用的包裝袋混裝、包裝袋破損泄露、包裝袋反復使用，物證袋生產環節出現污染等因素，都可以使檢材受到干擾，誤導檢驗結果。

提取過程造成的污染，主要是生物物證在實驗室提取檢驗時，操作人員操作不規范或者環境不達標等。例如物證進入實驗室后，檢驗人員初檢不認真，使用不潔器具操作，或者未及時更換PE離心管、移液槍槍頭等一次性耗材，未清洗或未按規定更換上樣膠墊等，都容易造成樣本提取時交叉污染?；蛘呤菣z測人員在檢測過程中不小心將自己的唾液或皮屑混入到檢材中，導致“烏龍檢材”的出現，也會對檢測結果造成影響。

1.3 DNA純化試劑、氣溶膠的污染

試劑在配制分裝過程造成的污染，尤其是移液器操作不當，最容易造成污染。特別在PCR擴增中最容易導致污染，因為在PCR擴增過程中，擴增的DNA產量是呈指數上升的，經過n個循環的擴增，一個DNA分子的產量便達到2n個拷貝。PCR產物一般為 1013拷貝 /mL，取 0.1 mL 即為 109拷貝，而 1 mg人基因組DNA才含1.4×106拷貝的單拷貝基因片段。PCR反應具有強大的擴增效率，使得極微量的污染便可導致假陽性結果。

另一種是氣溶膠的污染，主要是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體，又稱氣體分散體系。分散相為固體或液體小質點，其大小為10-3～10-7cm，分散介質為氣體。氣溶膠污染的一般原因是離心管管蓋松懈導致泄露，在PCR反應中，有高溫、低溫的周期性循環，高溫時，擴增反應液蒸汽溢出，擴增儀頂蓋密封不嚴，多次擴增不斷累積，達到足夠濃度時造成污染。此類污染難以清除，難以預測[7]。

1.4 核心設備污染

在提取、純化、擴增生物檢材DNA時，常用的儀器設備有高速冷凍離心機、恒溫振蕩儀、PCR擴增儀、3030XL遺傳學分析儀等設備。不按規定及時清洗，造成DNA產物分子級別堆積，形成設備內部污染。比如，有些檢驗人員在使用PCR擴增儀時，剛擴增完成就急于打開設備取樣，由于PCR擴增儀溫度還未降下來，反應體系也處于高溫狀態下，高溫膨脹使管蓋蹦出，會形成交叉污染。

2 生物檢材DNA污染對檢驗結果的影響

DNA污染可能導致假陽性的出現，干擾DNA分型圖譜的分析，誤導偵查人員。DNA污染可能會產生原本沒有的DNA信息，也可能會抑制、消除或完全覆蓋原有的DNA信息，從而造成嚴重后果[7]。比如可能在原本沒有犯罪嫌疑人DNA樣本的檢材上檢測出他的DNA，錯誤地刻畫犯罪嫌疑人，導致錯誤的案件定性，錯誤地推斷作案人數、作案人的性別等。這些都會誤導偵查方向，延誤破案時間。

3 預防生物檢材DNA污染的策略

在生物檢材DNA降低污染過程中，要做好“人防”和“物防”兩方面的工作，“人防”主要指在現場勘查中進行生物檢材提取時，勘察人員首先應樹立防污染的意識，首先做好自我保護，做到不污染樣品的同時也不讓樣品污染自己，勘查提取前先戴好口罩、帽子、防護服等必要措施，檢查勘查提取工具是否潔凈，確保樣品在源頭無污染，尤其是防止外來人源性污染。檢材越微量，越應防止外來人源性污染；因為檢材越微量，PCR檢驗對外來人源性污染越敏感?！拔锓馈敝饕冈趯嶒炇覚z測過程中防止實驗試劑、實驗室環境、核心設備等對樣品的污染。

3.1 遵守行業標準，按程序進行提取與檢驗

現場勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員在生物檢材提取、送檢、檢驗過程中，必須按照中華人民共和國公共安全行業標準《法醫學物證檢材的提取、保存與送檢》（GA/T169—1997）規定的相關內容進行操作。在實驗操作過程中嚴格按照儀器的操作規程進行，實驗試劑的使用要符合標準，不可使用過期或污染的試劑。特別是DNA提取過程使用的試劑，比如酶、超純水、提取液等，都應該進行分裝和隔離保管。最應注意的是移液槍槍頭的使用，必須是一次性的，按照一種試劑一個槍頭、一個樣品一個槍頭的原則，不可重復使用，交叉使用。

3.2 做好污染監測設置對照

必須要時刻注意污染的監測，監測樣品是否受到污染。通過有效的監測，采取正確的相應措施，防止或消除污染。另外對照試驗也是監測DNA污染的重要手段，所以無論是擴增還是遺傳學分析都應設置陰性和陽性對照。陰性對照是每次PCR實驗都必須做的，它包括了標本對照與試劑對照，通過對照確認樣本和試劑是否受到污染。陽性對照是對預期結果而設置的，它是PCR反應是否成功的一個重要的參考標志。

3.3 人才培養與培訓，提高行業人員能力

定期對相關人員包括現場勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員，進行業務培訓和專業知識學習，提高現場勘查能力和防污染意識，改變以往的“老牌作風”和“經驗主義”，加強規范操作，確保檢材質。

3.4 實驗室布局與環境要求要達標

生物物證受理室要和檢驗區完全隔離開，初步處理室物品要按照受理順序排好序，并保持潔凈，檢驗人員在進行物證初級處理室做好防護，這是保證樣品不污染的第一道程序。原始試劑混配室應為正壓間，操作過程在超凈臺內完成，須防止其他程序功能間對本操作間的污染[8]。PCR擴增室應為微負壓區域，必須設置排風系統，以防止大量擴增產物擴散污染其他程序功能間。檢測室也應為微負壓間，也必須設置排風系統，以防止擴增產物在電泳測序過程中的擴散污染；整個區域要注意溫度控制，因為DNA分析儀及其他分析設備散熱量較大，會提高室內溫度3～5 ℃，所以應做好溫度檢測。

所有實驗區域要進行定期消毒滅菌，紫外燈滅菌在開展實驗的2 h前進行，檢驗區域溫度控制在23℃左右。定時清洗維護核心設備，確保結果準確。

4 結語

生物物證檢材是DNA分析的原材料，避免檢材的污染問題必須做好“人防”和“物防”兩方面的工作，這是做好防止污染的第一步，防止DNA檢材污染，必須引起基層公安機關物證提取人員的高度重視，這不僅是相關檢驗人員的責任，也是整個法庭科學從業人員和刑事科學技術人員的責任[9-10]。相關從業人員應該提高自身技能、積極參加培訓，在實際現場勘查過程和檢驗中，嚴格按照標準操作，嚴控管理實驗室環境衛生，才能保障DNA鑒定結論的真實客觀，才能為法庭科學提供可靠依據。本文重點介紹了生物物證檢材在現場勘查和分析提取過程中常見的DNA污染途徑和環節，并針對各個環節提出了可行性的建議，有望為檢驗人員在生物物證提取、保存、送檢和檢驗等過程中提供參考。