嗜熱鏈球菌MN002凍干菌粉的制備工藝

李周勇，王凡，欒少萌，陳建國，康小紅

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司研發中心，呼和浩特011500）

0 引 言

嗜熱鏈球菌是乳制品行業最常見的發酵劑之一，廣泛應用于各種發酵乳制品的生產[1]。嗜熱鏈球菌菌粉的生產過程中，菌體分離及干燥技術最為關鍵[2]。因此，必須選擇合適的離心條件及蛋白溶解劑以提高菌體存活率[3]。冷凍干燥技術是目前全球范圍內乳酸菌保藏使用最廣泛及成熟的技術[4]。真空冷凍干燥過程中，冷凍速率、菌體濃度、凍干保護劑、貯存條件等都會對菌體存活率造成顯著影響[5]。本文對不同離心條件、蛋白溶解劑及凍干保護劑對嗜熱鏈球菌MN 002冷凍干燥的效果進行了研究，通過比較離心前后活菌數的變化及菌體存活率[6]，篩選出嗜熱鏈球菌MN 002最佳的離心條件及凍干保護劑組合，為嗜熱鏈球菌MN 002凍干菌粉的工業化生產提供理論依據和技術支持。

1 實 驗

1.1 材料

菌種：嗜熱鏈球菌MN 002（蒙牛自主知識產權菌種庫保藏菌株，使用超低溫冰箱于-80℃保存）。

試劑：脫脂乳粉（雀巢）、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥牙糖、糊精、抗壞血酸、甘油醇、吐溫80、甘油、蛋黃粉、谷氨酸鈉、氫氧化鈉、六偏磷酸鈉、檸檬酸鈉、MC瓊脂培養基，其他化學試劑均為分析純。

1.2 設備

DHP-9052電熱恒溫培養箱，武漢科輝；ALPHA 1-4 LD plus真空冷凍干燥機，德國christ公司；Bio-StatB生物發酵罐，德國貝朗公司；G560E漩渦混合器，美國SCIENTIFIC Instruments公司；Premium U 410超低溫冰箱，美國NBS公司；PB-10 pH計，北京賽多利儀器系統有限公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機，日立公司；ML51生物顯微鏡，日本Olympus；ACB-6A1超凈工作臺，新加坡ESCO公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干菌粉制備工藝[7]

菌種高密度培養→菌體離心富集→加入凍干保護劑→預凍處理→真空冷凍干燥

1.3.2 離心條件的控制

用無菌吸管將最優條件下培養的嗜熱鏈球菌MN 002培養物移入滅菌離心管中，上機離心，固定離心時間為5 min[8]，以菌體離心存活率及發酵液菌體離心濃縮倍數為指標[9]，對離心轉數和溫度進行篩選。測定離心前發酵液中活菌數記為離心前活菌數，離心后迅速棄上清，加入滅菌生理鹽水至離心前體積，測得離心后沉降菌體活菌數。

菌體離心存活率=離心后沉降菌體活菌數/初始發酵液活菌數×100%，

菌體離心濃縮倍數X=W/（W-W 1），

式中：W為測量時所取的10 g發酵菌液；W 1為發酵菌液經轉速3 000 r/min離心10 min所得的上清液質量。

1.3.3 蛋白洗脫液配方優化[10]

選取蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉[11]，單獨和混合復配使用。蛋白洗脫劑預先用少量蒸餾水溶解，再按濃度要求添加到增菌結束后的菌體培養液中混合均勻，20℃保持60 min[12]，在最優離心條件下離心，按1.3.2的方法測定菌體濃縮倍數。

1.3.4 凍干保護劑單因素篩選

嗜熱鏈球菌MN 002的凍干懸浮基質采用15%的脫脂乳[13]，按表1分別加入不同種類和濃度的保護因子，在100 mL三角燒瓶中充分混合并滅菌。按離心后的菌體2倍量充分混合制成菌體懸浮液，取1 mL菌體冷凍懸浮液移入西林瓶中，在凍干機中真空凍干，測定凍干后菌體的存活率[14]。

表1不同凍干保護因子的種類和添加量

1.3.5 復合凍干保護劑二次旋轉正交優化

根據單因素實驗結果，選取其中5種對菌體存活率有顯著影響的保護劑，以10%脫脂乳為基礎物質[15]，運用五因素二次旋轉正交組合設計優化嗜熱鏈球菌MN 002保護劑配方。實驗因素水平編碼如表2所示。

表2實驗因素水平編碼 %

1.3.6 其他指標測定方法

（1）活菌數測定[16]

按GB4789.35采用MC瓊脂培養基對嗜熱鏈球菌MN 002進行活菌計數（37℃需氧培養72 h，記錄菌落數）。

（2）凍干存活率

使用生理鹽水適當稀釋凍干菌，MC瓊脂培養基傾注平板，在37℃培養箱中培養72 h后計數菌落數，其凍干存活率為

凍干存活率=凍干后活菌數/凍干前活菌數×100%。

2 結果與分析

2.1 離心條件的選擇

固定離心時間為5 min，在不同離心轉數及溫度條件下，菌體離心存活率及離心濃縮倍數如表3所示。

表3不同離心條件下嗜熱鏈球菌MN002的離心效果

由表3可以看出，在轉速為8 000 r/min的高分離轉速條件下，4℃低溫組的存活率為80.0%，顯著高于25℃室溫組的48.3%(p＜0.01)；在4℃低溫條件下，轉速為8 000 r/min高分離轉數的存活率同樣顯著高于低分離轉數的活率(p＜0.01)。因此離心法濃縮菌體采用低溫和高分離轉數對菌數存活比較有利，這與胡仲秋等的研究結果一致[17]。實驗最終確定最佳離心條件為，離心轉速8000r/min，離心溫度4℃。

通過表3中的數據還可以看到，各實驗組菌體濃縮倍數均不是太高，分析原因，可能是在濃縮物中，由于嗜熱鏈球菌MN002產酸使得部分蛋白沉淀，并隨同菌體一起離心分離，這在很大程度上降低了離心效果[18]。因此，實驗下一步將對蛋白溶解劑進行優化，以獲得最優的菌體濃縮效果。

2.2 蛋白洗脫液配方優化結果

增菌發酵過程中乳蛋白發生一定程度變性，使離心沉淀物中伴隨有大量乳蛋白質，菌體濃縮倍數受到限制，為此選擇蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉[19]，并將其單獨和復配添加到增菌結束后的菌體培養液中，20℃保持60min后，于4℃條件下，轉速為8000 r/min離心處理5min，菌體濃縮倍數測定結果如表4所示。

表4添加復合鹽類的菌體離心濃縮倍數

由表4可以看出，蛋白洗脫液的加入大大提高了菌體濃縮倍數，且將蛋白洗脫劑六偏磷酸鈉和檸檬酸鈉復配使用的效果明顯優于洗脫劑單獨作用，以第四組實驗中的0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉配合及第五組實驗中的0.20%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉復配洗脫效果最好，考慮到生產成本，最終我們選擇0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉復配，作為最佳的蛋白洗脫液組合。

2.3 凍干保護劑單因素篩選結果

菌體冷凍干燥后的存活率受多種因素的影響，而保護介質是其中重要的影響因素，良好的保護劑要求其在凍干過程中能提供菌體保護作用，降低菌體死亡，同時能有較好的自身穩定性且有利于再水合，還可方便有效的除去凍干材料中的多余溶劑[20]。試驗以15%的脫脂乳為對照，對嗜熱鏈球菌冷凍干燥保護效果較好的大分子、鹽類、糖類及單分子等多種保護劑進行了研究，以篩選適合嗜熱鏈球菌MN002的凍干保護劑。

由表5可以看出，除蛋黃由于凍干后與菌體粘在一起，十分黏稠未能檢出，其它所選保護劑對嗜熱鏈球菌均有一定的保護效果。其中甘油醇、吐溫80、糊精對菌體凍干保護作用相當(p＞0.05)，對菌體存活率提高較少。海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉對菌體凍干保護作用相當(p＞0.05)，對菌體存活率提高最大。海藻糖與甘油是應用較為廣泛的凍干保護劑[21]，在本試驗中它們的效果較好。許多研究發現谷氨酸鈉可以提高大多數乳酸菌冷凍和冷凍干燥的存活率，這與本研究結果一致，這是因為谷氨酸鈉氨基基團與微生物蛋白質的羥基基團之間的反應穩定了蛋白質的結構，且保留了較大的水分含量[22]。蔗糖、乳糖、麥芽糖效果相當(p＞0.05)，對菌體存活率提高較大，從應用范圍及成本考慮，選取蔗糖作為其中一個主要保護因子。因此，我們最終選擇蔗糖、海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉作為主要影響因子，進行下一步優化實驗。

表5嗜熱鏈球菌MN002凍干保護劑單因素實驗結果

2.4 復合凍干保護劑優化結果

在單因素試驗的基礎上，選取蔗糖、海藻糖、抗壞血酸、甘油及谷氨酸鈉作為保護劑組分，按表2的水平設置，采用二次旋轉組合設計對嗜熱鏈球菌MN002的復合凍干保護劑進行優化，凍干后嗜熱鏈球菌MN002存活率如表6所示。

2.4.1 保護劑模型及分析

以嗜熱鏈球菌MN002菌體存活率（Y）為響應值，采用DPS數據處理軟件進行多元回歸分析，得到多元二次回歸模型如下：

式中：x1，x2，x3，x4，x5分別為蔗糖、甘油、谷氨酸鈉、抗壞血酸、海藻糖質量分數的編碼值。

由表7可以看出：F1=0.2987＜F0.05(6，9)=3.69，F2=17.4351＞F0.01(20，15)=3.37。F1檢驗通過，說明二次正交旋轉組合設計所選擇的5個因素（蔗糖濃度、甘油濃度、谷氨酸鈉濃度、抗壞血酸濃度、海藻糖濃度）是最主要因素，并無其他主要因素，實際規律滿足二次方程條件，無更高次項的干擾。F2檢驗通過說明回歸模型是顯著的，與實際情況擬和的較好。

利用t檢驗在ɑ=0.01顯著水平對模型中各回歸系數進行有效性檢驗，剔除不顯著項后，模型（1）回歸方程可簡化為

Y=0.8430-0.0653x12-0.0654x22+0.0064x3-0.0723x32+0.0072x4-0.0658x42+0.0060x5-0.0683x52， （2）

表6二次回歸旋轉組合設計及實驗結果

表7方差分析結果

各因素對指標值的貢獻率為x1=5%，x2=2%，x3=0.8%，x4=1%，x5=5%；x3(0.9872)＞x5(0.9864)＞x4(0.9853)＞x1(0.9843)＞x2(0.9837)，即谷氨酸鈉質量分數＞海藻糖質量分數＞抗壞血酸質量分數＞蔗糖質量分數＞甘油質量分數。

2.4.2 單因素分析

將模型中的4個因素分別固定在（-2，-2）、（0，0）、（2，2）的水平上，對第5個因素進行單因素分析，得到5個因素分析結果如下圖1-圖5所示。

圖1蔗糖對MN002的保護作用

圖2甘油對MN002的保護作用

圖3谷氨酸鈉對MN002的保護作用圖

圖4抗壞血酸對MN002的保護作用

圖5海藻糖對MN002的保護作用

由圖1-圖5可以看出，每種保護劑對凍干存活率的單因素影響趨勢基本一致，均為拋物線關系，MN 002存活率隨各保護劑濃度的增加先增加至某一極值點后又開始下降。每組曲線中曲線2的值均高于曲線1和曲線3，這說明5種保護劑單獨作用時，其他4種保護劑在零水平附近利于其保護作用的發揮。

2.4.3 雙因素分析

將模型B中每三個因素一組，固定在零水平，就可得到另外二個因素對凍干存活率影響的子模型，根據該子模型，可分別繪制每兩因素協同作用對存活率影響的曲面圖。本研究為五因素旋轉設計，因此可得 10個子模型和相應10組曲面圖，如圖6所示。

圖6兩因素協同作用對MN002存活率的影響

由圖6可以看出，保護劑兩因素協同作用對MN 002凍干存活率的影響具有很大相似性。每組曲面的影響趨勢均表現為：當因素1為固定水平時，指標值隨因素2的增加而增加，增加至某一值后，又隨因素2的增加而降低，當因素2為固定水平時，因素1的變化趨勢也是如此，只是部分曲面的走勢略有不同。例如以圖6（a）為代表，蔗糖與甘油協同作用時，MN 002凍干存活率升降趨勢較明顯，以圖6（e）為代表，甘油與谷氨酸鈉協同作用時，MN 002凍干存活率升降趨勢較平緩。兩因素均取適中值時，容易獲得較大存活率，這與單因素分析的情況對應。另外，從圖6（a-d）比較可知，已知較為有效的保護劑蔗糖與其它滲透性保護劑和非滲透性保護劑之間的協同作用區別不大，從圖6（c）可見蔗糖與抗壞血酸鈉的協同作用較好。

2.4.4 驗證實驗

通過回歸模型方程式求Y極值，可得在本試驗條件下，菌體存活率的理論極值F max=84.8%，此時最佳保護劑組合為x1=5%，x2=2%，x 3=0.8%，x 4=1%，x5=5%；即蔗糖質量分數5%，甘油質量分數2%，谷氨酸鈉質量分數0.8%，抗壞血酸質量分數1%，海藻糖質量分數5%。在實驗所得最佳條件下進行重復實驗驗證，MN 002菌體存活率可達84.2%，與理論極值接近，進一步驗證了保護劑模型的合理性。

3 結 論

試驗對不同離心條件下嗜熱鏈球菌MN 002的存活率進行了研究，發現在離心轉速為8 000 r/min，離心溫度4℃條件下，菌體離心存活率最高。同時，以菌體濃縮倍數為指標，對蛋白洗脫劑進行了組合研究，發現0.15%六偏磷酸鈉和0.5%檸檬酸鈉配合使用效果最好，可大大提高MN 002菌體濃縮倍數。

以嗜熱鏈球菌MN 002凍干存活率為指標，通過單因素實驗和二次正交旋轉組合設計實驗，建立了凍干存活率與蔗糖質量分數、甘油質量分數、谷氨酸鈉質量分數、抗壞血酸質量分數以及海藻糖質量分數的回歸模型，該模型與實際擬合性好，能有效反映實際情況。通過對回歸方程進行分析，得到了最佳的菌體凍干保護劑組合：蔗糖為5%，甘油為2%，谷氨酸鈉為0.8%，抗壞血酸為1%，海藻糖為5%（均為質量分數），MN 002菌體存活率的理論極值為84.8%。各因素對菌體存活率的影響大小為谷氨酸鈉質量分數＞海藻糖質量分數＞抗壞血酸質量分數＞蔗糖質量分數＞甘油質量分數。