一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗方法的研究

鄭朝朝,劉云濤,李倬,鄒立宏,郁宏偉*

（1.瑞普（保定）生物藥業有限公司，河北保定071000；2.河北省獸醫生物技術工程技術研究中心，河北保定071000；3.吉林省進出口檢驗檢疫局，長春130062）

豬瘟病毒和豬瘟疫苗效力檢驗主要依靠兔體定型熱反應方法（RID）[1]，試驗成本較高、操作繁瑣、試驗周期較長，且受實驗動物個體差異和環境因素等多方面影響，檢測結果不夠準確，造成疫苗成品質量不穩定[2－3]，甚至免疫失敗。

相關文獻中有很多關于免疫熒光檢測法（FA）[4]、酶聯免疫吸附法（ELISA）[5－6]、聚合酶鏈式反應法（PCR）[7]和實時熒光定量PCR法（Realtime PCR）[8－9]等檢測豬瘟活疫苗效力的報道[10]，但都有各自的缺陷，如不能有效區分活病毒與失活病毒、重復性差、操作復雜等，最終未能全面推廣。本研究建立了一種快速、準確、穩定檢測豬瘟病毒含量及疫苗效力的間接免疫熒光法（IFA），以便能更加準確評價豬瘟活疫苗效力和豬瘟半成品病毒含量，滿足規模化生產的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 豬瘟抗體陽性血清（一抗），購自中國獸醫藥品監察所，批號2009002；FITC標記的兔抗豬熒光抗體（二抗），購自SIGMA公司，批號2015002；甲醇、丙酮、PB、氯化鉀、氯化鈉等試劑，均為分析純，購自北京益利化學試劑公司。

1.1.2 細胞 豬睪丸細胞（ST），由瑞普（保定）生物藥業有限公司種毒室提供。

1.1.3 樣品 瑞普（保定）生物藥業有限公司2013－2014年生產的豬瘟活疫苗成品20批、半成品90批。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇、培養 常規方法復蘇ST細胞，培養至細胞長成良好單層后用0.25%胰酶消化分散，并用細胞生長液重懸，接種于96孔細胞培養板，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h，備用。

1.2.2 效價檢測

1.2.2.1 兔體定型熱反應檢測 按照國標中豬瘟活疫苗效力檢驗方法對被檢疫苗進行稀釋，用RID法檢測被檢樣品的效力。

1.2.2.2 熒光檢測 倍比稀釋各被檢樣品，制備成不同稀釋度的病毒液備用。棄去96孔板內細胞生長液，用0.01 mol/L的PBS沖洗一遍后將0.1 mL病毒液與PB液（1∶1）混勻加入96孔培養板，每個稀釋度設6個復孔。同時設置不加PB液的對照孔及陰性、陽性對照孔。接毒后細胞培養板置于37℃孵育2.5 h，孵育結束后棄去病毒液，用0.01 mol/L的PBS沖洗一遍，補充維持液繼續培養3 d，采用IFA法檢測樣品的TCID50。

1.2.3 重復性試驗 隨機抽取豬瘟活疫苗成品、半成品樣品各5批次，應用本研究中建立的檢測方法和RID法進行效力檢測，均重復兩次，統計檢測結果。

2 結果與分析

2.1 與常規熒光檢測方法對比 本研究中IFA法檢測豬瘟病毒效力時加入了PB，明顯提高了豬瘟病毒對細胞的感染率:本法中樣品稀釋16000倍接種96孔細胞培養板，培養3 d后，特異性熒光孔數多，單孔熒光廣泛（圖1），較常規免疫熒光法（圖2）明顯提高。PB單獨處理空白細胞不會產生特異性熒光（圖 3）。

圖1 本研究IFA檢測結果Fig 1 Results of IFA detection by this method

圖2 常規FA檢測結果Fig 2 Conventional FA detection results

圖3 PB處理空白細胞IFA結果Fig 3 IFA results of blank cells treated with PB

2.2 與兔體定型熱反應檢測法的相關性 通過對20個豬瘟活疫苗成品、90個豬瘟活疫苗半成品的效力檢測結果進行統計得出了IFA法與RID法對應關系圖（圖4和圖5）。

圖4顯示，兔體檢測7500 RID/mL的樣品，熒光檢測TCID50/0.1mL集中在28.8以上；兔體檢測1.5×104RID/mL的樣品 TCID50/0.1mL集中在28.8至29.8之間；兔體檢測3.0×104RID/mL的樣品TCID50/0.1mL集中在29.7以上。

圖5表明，兔體檢測1.0×105～3.0×105RID/mL的半成品樣品，TCID50/0.1mL集中在212.11以上，3.0×105～5.0×105RID/mL樣品TCID50/0.1mL集中在213.03至213.96；兔體檢測5.0×105～8.0×105RID/mL樣品，熒光檢測 TCID50/0.1mL集中在213.34至214.46；兔體檢測8.0×105RID/mL以上合格樣品，熒光檢測TCID50/0.1mL集中在214.4以上。

圖4 成品檢測結果Fig 4 Results of product

圖5 半成品檢測結果Fig 5 Results of Semi-finished product

2.3 重復性試驗結果 應用本研究IFA法和RID法分別對豬瘟活疫苗成品、半成品進行效力檢測，統計兩次檢測結果見表1和表2。

表1 兩種方法檢測成品結果比較Tab 1 Results of product by two detection methods

表2 兩種方法檢測半成品結果比較Tab 2 Results of Semi-finished product by two detection methods

如表1所示，用IFA和RID兩種效力檢測方法對5個批次的成品進行復核檢驗，IFA法兩次結果復核率為100%，而RID法兩次結果復核率為80%。

如表2所示，用IFA和RID兩種效力檢測方法對5個批次的半成品進行復核檢驗，IFA法兩次結果復核率為100%，而 RID法兩次結果復核率為73%。

3 討論與結論

通過上述實驗結果可以看出，本研究中所建立的IFA法與RID法有良好的對應關系，能夠準確、快速檢測豬瘟疫苗成品、半成品效力。

本研究所建立的IFA法較常規免疫熒光法敏感性更高，通過在病毒液中增加促細胞感染劑PB定向增加豬瘟病毒與寄主細胞接觸面積，從而提高了病毒對細胞的感染率，提高了疫苗檢測的敏感性。解決了常規免疫熒光法因細胞感染率不高所導致的不穩定、重復性差的問題，同時避免了RID法中因兔體差異、環境因素、操作繁復所造成的誤差。

本研究中IFA法的建立是以RID法為基礎，而檢測準確度、可重復性高于RID法。如RID法檢測140703批成品疫苗時，出現了7500 RID/mL兩次檢測均不合格，而1.5×104、3.0×104RID/mL檢測均合格的情況；檢測半成品疫苗時，也多次出現了低倍數稀釋半成品疫苗效力檢驗不合格，而高倍數稀釋效力檢驗合格的情況。而IFA法檢測結果更為準確，兩次檢測結果復核率可達到100%。

本研究將IFA法應用于檢測豬瘟活疫苗成品、半成品效力，理論上來說其檢測結果（TCID50）與疫苗效力應當有良好的直線對應關系，但實際成品檢測結果各檢測梯度間TCID50相差不大，而半成品檢測結果中相鄰的檢測梯度間也有較大的重疊區，這可能是RID法檢測各樣品時并未檢測至終點（疫苗實際效力高于檢測值），導致與之對應的TCID50偏高。因此本研究仍需要更多數據建立IFA檢測結果與疫苗實際效力的直線對應關系，進一步提高檢測的準確性。