電刺激對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響

李秀紅

【關鍵詞】大鼠;電刺激;脊髓損傷;神經生長因子;神經修復

在中樞神經系統中，脊髓部位極易受損。而脊髓損傷可嚴重影響人的脊柱健康，致殘率高，甚至危及患者生命。目前，脊髓損傷后的神經修復仍屬于世界性難題，神經生長因子作為神經營養因子的典型代表，其可在一定條件下促進未損傷神經元出芽，從而有利于被破壞神經回路的重建。因此，神經生長因子對脊髓損傷后的重建發揮著重要作用。電刺激是通過發出接近人體生物電的微量電流來促進神經生長因子的表達，從而促進受損神經元恢復、修復脊髓損傷。本實驗旨在觀察電刺激對大鼠脊髓損傷后神經生長因子表達的影響，從而為臨床治療提供借鑒。

1材料與方法

1.1實驗動物選取健康成年SD大鼠48只，體重（196±20.3）g，雌雄不限。所有大鼠分籠飼養，飼養環境溫度在20～25℃。隨機分成3組，正常組（n=16）、電刺激組（n=16）和損傷對照組（n=16），各組再分成造模后1d、3d、5d、7d亞組，每個亞組4只。

1.2方法

1.2.1制備動物模型：電刺激組及損傷對照組大鼠均腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉45mg/kg進行麻醉，并給予背部剃毛、消毒，并切開皮膚及皮下組織，使得棘突與椎板暴露，將T9椎板咬除，然后采用沖擊棒在高度為25mm處使大鼠自由墜落致使脊髓損傷，縫合傷口。精心護理并獨籠飼養，并給予協助排尿、抗菌、補充體液，預防壓瘡、感染等，一直持續到大鼠取材，正常組切除相應椎板并給予切口縫合。

1.2.2電刺激：電刺激組大鼠于術后24h開始給予經皮電刺激，每次30min，1次/d，直至取材。采用疏密波脈沖電流，選擇中檔電流強度，以10Hz為刺激頻率，負極與右下肢小腿位置的皮膚連接，正極與損傷部位上緣約2cm處皮膚連接。

1.2.3取材：術后1d、3d、5d、7d時對各組大鼠進行取材，采用高劑量戊巴比妥鈉過度麻醉大鼠，然后左心室插管、右心耳剪開，灌注冰生理鹽水、肝素鈉，見右心耳流出澄清液后再灌注4%多聚甲醛1h，將椎弓管打開，切除T7-T11段脊髓，并進行固定，24h后進行脫水、修片、切片、貼片、烤片，處理完成后備用。

1.2.4免疫組織化學染色：采取非生物素二步法對神經生長因子免疫組化染色，先將各組切片脫蠟、梯度酒精水化，然后高壓熱抗原修復，封閉內源性過氧化物酶及特異性抗原，再將NGF抗體滴入后冰箱過夜。采用兔抗鼠二抗在溫度為37℃恒溫狀態下孵育1h，加DAB-H2O2顯色液到切片，室溫環境下反應并采用顯微鏡觀察，然后漂洗、復染、脫水，樹膠封片。通過顯微鏡觀察神經生長因子表達，見棕黃色反應為陽性。

1.3觀察指標觀察脊髓內神經生長因子陽性產物的分布情況，并對各組脊髓內、中、外的神經生長因子陽性細胞數進行統計，測量其平均積分光密度值。

1.4數據處理采用SPSS19.O，用（π±s）表示計量資料，采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2結果

見表1，電刺激1d時，電刺激組的神經生長因子平均積分光密度值及陽性神經元數相對于正常組和損傷對照組有所增加，但無顯著性差異（P>0.05）;電刺激3d、5d、7d時電刺激組和損傷對照組的上述兩項指標顯著高于正常組（P<0.05），電刺激5d、7d時，電刺激組的上述兩項指標顯著高于損傷對照組和正常組（P<0.05）。

3討論

研究證實，神經元軸突生長及定向致靶狀況以及神經元的存活質量是脊髓損傷后功能恢復的重要影響因素。神經生長因子屬于神經營養素家族中的重要一員，其來源于靶組織，并對神經元產生逆向營養作用，對促進靶器官與皮質脊髓束建立聯系有重要作用，而且可逆轉受損神經元的萎縮，從而提高神經元存活率，促進受損神經的修復。

本實驗結果顯示，電刺激開始后，隨著電刺激時間的延長，電刺激組的神經生長因子表達成上升趨勢，電刺激3d、5d、7d時電刺激組和損傷對照組的神經生長因子平均積分光密度值及陽性神經元數顯著高于正常組，電刺激5d、7d時，電刺激組的上述兩項指標顯著高于損傷對照組和正常組（P<0.05），本實驗結果提示兩點：一是脊髓損傷后，神經生長因子分泌增加，相比未發生脊髓損傷組呈現高表達;二是電刺激治療有助于刺激神經生長因子分泌，進一步增加其在脊髓損傷部位的含量。研究顯示，中樞神經系統受損后，其神經生長因子加速分泌，從而發揮其維持受損部位神經元存活、促進神經纖維再生等作用，可見，神經生長因子在促進受損神經元修復方面發揮著重要作用。研究證實，對于中重度脊髓損傷來說，在沒有外界干預情況下，受損機體的內源性神經生長因子表達量并不能完全達到保護和修復神經元的水平，而且其維持時間較短。因此，不少學者提出通過增加外源性神經生長因子的表達來滿足受損機體神經元修復所需，從而促進受損神經元的快速康復，本實驗結果證實了這一建議的可行性。實驗中發現，經皮電刺激治療將微量電流的正負極分別與T 9右側夾脊穴和右下肢足三里穴相連接，從而在受損區周圍搭建了一個外在電場，通過電流刺激來提高神經生長因子的分泌。本實驗中發現，神經生長因子免疫反應陽性物多集中于大鼠灰質前角神經元內，并多數定位于細胞核和胞漿中，說明電刺激后刺激受損區域有助于增加其神經生長因子的分泌，與以往文獻結果一致。

綜上所述，脊髓損傷后電刺激能夠誘導大鼠損傷區神經生長因子的表達，這將為損傷區神經元的恢復創造有利的微環境。