CRISPR/Cas9基因編輯技術研究進展

陳楠楠

（蘇州大學，江蘇蘇州 215000）

在CRISPER-Cas9基因編輯技術創建之前，人們已找到兩種可以特異性切斷DNA雙鏈的酶，一種是鋅指核酸酶（ZFNs），另一種是利用類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）。ZFNs是由多個鋅指基序串聯成的DNA識別域和非特異性核酸內切酶FokⅠ的羧基端功能域組成的融合蛋白，當兩個ZFN分別結合到DNA的兩條鏈上間隔5～7個堿基的靶序列后，進而激活FokⅠ核酸內切酶的剪切結構域，使DNA在特定位點產生雙鏈斷裂。但是，鋅指基序同其靶序列的對應性并不特異，而且在基因組上找到合適的ZFN靶點也比較困難。TALENs是將特異性DNA結合結構域TALE代替ZFNs的鋅指基序改造而成，但是TALE的識別位點有限。CRISPR/Cas9技術有效的利用了RNA-DNA的特異配對特性，并簡化了設計過程，使應用范圍更廣泛。

1 CRISPR序列的發現（1987—2002年）

1987年，日本的Nakata實驗室在分析大腸桿菌基因iap及臨近序列時發現在iap基因的3'端存在多個含有29個堿基且高度同源的重復序列，這些重復序列之間包含32個堿基的間隔序列。真正對這些序列著迷的是FranciscoMojica。他的導師在前期研究中發現鹽的濃度會影響Haloferaxmediterranei DNA酶切片段的大小，Mojica便尋其中的原因。他在分析DNA片段的序列時發現了與Nakata實驗室所發現序列類似的“重復-居間序列-重復”序列[1]。隨后的幾年里，Mojica在多種微生物中都找到了類似的序列，并意識到這些序列可能在微生物中發揮重要作用。后來，Mojica將這種“重復-居間序列-重復”序列命名為SRSRs。到2000年，Mojica在20種不同的微生物基因組中發現了類似序列[2]。兩年后，Ruud Jansen在研究這些序列過程中發現了許多與其關聯的核酸酶。與Mojica交流后，這種序列結構被正式命名為CRISPR，與之相關的核酸酶則被命名為Cas[3]。雖然人們鑒定到了大量CRISPR序列，但對其生物學功能則毫無所知。

2 CRISPR功能的初步探索（2002—2005年）

得益于數據庫的不斷豐富，在2003年，Mojica通過BLAST發現來自E.coli的居間序列能匹配侵染E.coli的P1噬菌體序列，而包含這些居間序列的E.coli菌株對P1噬菌體具有顯著的抗性。經過一周的艱苦努力，Mojica分析了4500條居間序列，找到了88條有資料可查的序列，其中2/3的序列為病毒或外源質粒的序列，他意識到CRISPR/Cas系統可能與細菌的獲得性免疫有關[4]。同一時期，法國的兩個實驗室也分別獨立得出了類似的結論。就職于法國國防部的Gilles Vergnaud在分析61份Y.pestis樣本后，得出了與Mojica一致的結論，即CRISPR與細菌的獲得性免疫有關[5]。同時，Alexander Bolotin提出了微生物中CRISPR序列染色體外起源的假說[6]。

3 CRISPR/Cas免疫系統的解析和建立（2005—2012年）

2005年開始，CRISPR得到了更多的重視。2005年，Philippe Horvath等在法國羅地亞食品公司成立了一個研究小組，研究Mojica等人提出的CRISPR可能與細菌的獲得性免疫相關的假說。他們建立了由一個對噬菌體敏感的S.thermophilus菌株和兩個噬菌體組成的研究體系，發現菌株對噬菌體抗性的獲得與菌株CRISPR位點獲得噬菌體來源的序列相關[7]，當噬菌體中相應的序列發生突變后，該菌株的噬菌體抗體則喪失。在后續的研究中，他們收集了大量具有不同程度免疫缺陷的菌株，并利用這些資源證實Cas7對菌株在CRISPR位點獲得噬菌體來源的序列是必需的，而與序列獲得后的抗性無關；而酶學專家VirginijusSiksnys證實，Cas9對菌株維持噬菌體抗性是必需的[6]。同一時期，在瓦格寧根大學的實驗室中，John van der Oost和EugeneKoonin合作，利用E.coli建立了另外一個研究CRISPR與細菌獲得性免疫關系的研究系統，并分析了其中的5個Cas蛋白（Cascade）的功能[8]。他們發現Cas能將CRISPR位點轉錄來的RNA前體剪接為61個堿基大小的成熟crRNA（CRISPR RNA）。為了驗證crRNA對于CRISPR介導的免疫抗性是必需的，他們在細菌中建立了第一個人工CRISPR/Cas系統，證實了其介導細菌抗噬菌體的能力，并猜測crRNA靶向DNA而不是傳統認為的anti-RNA。

證實CRISPR系統靶向DNA的是盧西亞諾·馬拉夫尼（Luciano Marraffini）等人。馬拉夫尼在芝加哥大學攻讀博士學位時，接受了噬菌體遺傳學權威人物Malcolm Casadaban的建議著手研究CRISPR。當時人們已普遍懷疑CRISPR anti-RNA理論，于是馬拉夫尼大膽推測，CRISPR能像限制性內切酶一樣直接切割DNA。后來，馬拉夫尼與Erik Sontheimer合作，證實CRISPR可以像抵御病毒一樣破壞轉化的質粒[9]。為了進一步證實此事，他們構建了一個體外CRISPR免疫系統，確證CRISPR靶向DNA。他們甚至通過改造CRISPR免疫系統，在真核細胞中實現對染色質DNA的剪切。但馬拉夫尼等人在設計這些實驗時并不知道是哪個Cas起到了DNA內切酶的功能，這導致了他們的實驗設計存在大量問題，因此沒有引起人們的重視。最終，Sylvain Moineau等人利用手中的免疫缺陷菌株研究發現切割質粒取決于Cas9核酸酶。當他們對質粒進行測序時，發現切割發生在PAM序列上游3個核苷酸處，這一關鍵序列特征與他們早期論文中所描述的一致[10]。

盡管CRISPR/CAS9系統已經完整，但還有一個謎團，即被稱為trans-activating CRISPR RNA（tracrRNA）的小RNA。tracrRNA最早由Emmanuelle Charpentier在病原菌中發現，后經J?rgVogel分析發現該小RNA是由緊鄰CRISPR的序列轉錄而來，并包含一個由25個堿基組成，與CRISPR序列互補的序列。后經基因敲出實驗證明，tracrRNA指導crRNA的成熟過程[11]。后經Siksnys等人的研究表明，tracrRNA還有另一個關鍵作用，即對于Cas9核酸酶復合物的形成是必需的[12-13]。就在Siksnys等人解析Cas9的酶學結構時，Charpentier與結構生物學家JenniferDoudna開展合作，發現從E.coli中純化的Cas9能與純化的crRNA和tracrRNA在體外形成功能復合體，更重要的是，他們發現將crRNA和tracrRNA融合成一條RNA（sgRNA）時，Cas9復合體的功能不受影響，并指出“該系統在RNA指導的基因組編輯方面具有巨大潛力”[12]。

4 CRISPR/Cas9技術的歷史性突破（2012—2013年）

在解析CRISPR/Cas免疫系統的過程中，有兩件具有里程碑意義的成果，即CRISPR/Cas免疫系統在不同微生物間的移植和在體外的成功重建。在接下來的研究中，科學家張峰取得了首屈一指的成果。當時TALENs研究剛興起，張峰等人與來自SangamoBioSciences的另一實驗室分別成功地將TALENs應用在哺乳動物細胞中。2011年2月，張峰首次接觸到CRIAPR/Cas9系統，兩個月后他便在哺乳動物細胞中實現了sgRNA介導的熒光報告基因的表達調控，但效果并不理想。接下來的一年中，張峰對CRIAPR/Cas9系統進行了優化。2012年，他建立了一個由Cas9、tracrRNA和CRISPR序列三種元件組成的基因調控系統，以及包含16個基因的CRISPR文庫。他發現該系統可以同時準確高效地突變多個基因序列。接下來，他檢測了由Cas9和sgRNA兩種元件組成的系統，發現sgRNA的3'端發夾結構在激活Cas9的過程中發揮重要作用[14]。

5 后CRISPR/Cas9時代（2013年至今）

自CRISPR/Cas9技術被證明可以高效準確編輯哺乳動物基因序列后，關于CRISPR/Cas9的科學報道迅速席卷生命科學的各個領域，CRISPR/Cas9技術在應用方面實現迅猛拓展，概括來講可以分為基因組編輯、轉錄調控、RNA調控及基因組定位。除了科研領域，CRISPR/Cas9還對社會思想帶來了巨大沖擊，特別是基因編輯嬰兒的誕生，引發了關于CRISPR/Cas9倫理的廣泛討論。但無論如何，CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現為人類戰勝遺傳性疾病及癌癥等嚴重疾病帶來了新的希望，具有不可估量的價值。