Mn-SOD的提取及其應用研究進展

秦 松,何雨峰,況嘉鈾,范淑敏,黃邵培,王偉平

(發酵工程教育部重點實驗室,湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068)

超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于生物體內的金屬酶,是良好的超氧陰離子自由基清除劑,能夠催化細胞體內的超氧陰離子自由基,生成氧和過氧化氫。SOD主要存在于動物植物及微生物中[1]。根據其所含金屬輔基的種類,可分為CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。Fe-SOD主要存在于原核細胞及一些植物中;CuZn-SOD主要存在于真核細胞細胞漿、葉綠體和過氧化物酶體內;而Mn-SOD主要存在于真核細胞線粒體和原核細胞內[2]。Mn-SOD是由約203個氨基酸殘基構成的四面體,結構簡單[3],其在原核生物中多為二聚體,在真核生物中多為四聚體,各亞基基本相同,每個亞基的相對分子質量一般為23 kDa,平均每個亞基含0.5～1個Mn原子。線粒體是細胞呼吸的主要場所,而氧化呼吸鏈的電子傳遞過程是機體形成自由基的重要方式之一。因此,位于線粒體內的Mn-SOD作為清除超氧陰離子的第一道防線,它在生物體內的表達和調控對于平衡機體的氧化還原穩態的維持起著十分重要的作用。近年來,關于Mn-SOD的研究不斷深入,Mn-SOD的生理特性引起了人們的濃厚興趣,與其相關研究也日趨活躍。本文就Mn-SOD的動植物以及微生物來源、基因工程菌生產及其應用進展進行綜述。

1 Mn-SOD的提取

Mn-SOD是一種具有生物活性的酶,其本質是蛋白質。因此,Mn-SOD的生產提取本質是蛋白質的提取分離。然而,和一般蛋白質的提取相比,由于在細胞內含量很少,生產提取Mn-SOD較為復雜;同時,Mn-SOD作為具有生物活性的大分子物質,在提取純化的過程中需要選取恰當的方法。

1.1 從動物中提取Mn-SOD

Mn-SOD在動物肝臟[4-5]、心臟[6]、肌肉[7]等中含量豐富。提取動物組織中Mn-SOD的普遍做法是以動物的肌肉、內臟為材料,進行機械勻漿,然后經過有機溶劑、鹽類沉淀或層析柱分離得到Mn-SOD。

Mn-SOD首先是以無活性形式從雞肝中分離得到的,當時被稱為“禽錳素”[5]。隨后,又從人肝中分離到該蛋白質,即Mn-SOD[4]。任美鳳等[6]將雞心用機器破碎成勻漿并進行抽提,用正丁醇除脂,然后丙酮分級沉淀,得到Mn-SOD。該酶的比活是1633 U/mg,純化倍數139.16,全分子相對分子質量為103.7 kDa,其亞基相對分子質量23.6 kDa。Makoto Ikebuchi等[7]通過扇貝肌肉組織分離得到Mn-SOD,并測得扇貝Mn-SOD的相對分子質量約為93～95 kDa,其由四個相同的分子量約為24～25 kDa的亞基組成。姚翠鸞[8]將使用熱處理、硫酸銨分級鹽析和柱層析等方法,從日本沼蝦肌肉組織分離得到Mn-SOD,其亞基分子量約為20 kDa。

以上可以看出,一般動物源所得到的Mn-SOD相對分子質量較大,約為100 kDa左右,且都具有分子量約為20 kDa的亞基。

1.2 從植物中提取Mn-SOD

從植物中分離Mn-SOD,一般是以植物的葉片為材料[9-12],經破胞沉淀得到均一Mn-SOD。除此之外,采用金屬螯合親和層析并結合離子交換層析同樣可以得到Mn-SOD。

楊雄等[9]通過對韭菜線粒體進行硫酸銨沉淀經硫酸、柱層析和凝膠過濾,將韭菜線粒體SOD純化到均一程度,得到韭菜Mn-SOD,分子量為82 kDa,由四個相同分子量約為22 kDa亞基組成,酶比活力達1200 U/mg蛋白。鄒國林等[10]通過小白菜線粒體成功獲取Mn-SOD,其亞基相對分子質量為21.8 kDa,酶比活力為1289 U/mg。趙曉瑜等[11]利用金屬螯合親和層析,結合DEAE-纖維素離子交換層析,從玉米勻漿液中分離純化到電泳純的Mn-SOD組分,通過雙向電泳和SDS-PAGE分析表明,玉米Mn-SOD的亞基分子質量26.2 kDa,等電點為5.3。程光宇等[12]從朱桔葉分離得到Mn-SOD,分子量為54.0 kDa,該酶在SDS-PAGE圖譜上呈現單一區帶,其亞基分子量為26.6 kDa,酶比活性為1249 U/mg。饒麗莎等[13]采用qRT-PCR技術,分析杉木不同組織部位Mn-SOD基因的表達量差異發現,Mn-SOD在杉木葉片中表達較高,而根和莖表達量相對較低,這也為主要采用植物葉片作為原材料來提取植物Mn-SOD提供了依據。

可以看出,不同植物來源的Mn-SOD相對分子質量有所不同,但都具有亞基,酶活均為1300 U/mg左右。然而,一般而言,通常在植物組織中富含有機酸、維生素、微量元素及酚類和黃酮類物質,在提取Mn-SOD的過程中需要注意選擇恰當的方法,避免酶活性的喪失。

1.3 從微生物中提取Mn-SOD

由于動植物的資源相對有限,工藝較為繁雜,為了得到大量的Mn-SOD,許多研究學者將Mn-SOD獲取來源轉向微生物。從微生物中分離Mn-SOD,以微生物菌體為材料,一般采用硫酸銨進行分級沉淀、柱層析以及離子交換的方法。

侯玉艷等[14]采用熱擊法和硫酸銨分級沉淀法對所提取的黑脈羊肚菌SOD進行純化,對純化后酶的熱穩定性、pH穩定性、敏感性及同工酶類型等進行研究。該熱擊法最佳熱擊溫度為60 ℃,最佳熱擊時間為15 min;而硫酸銨分級沉淀法最佳鹽溶條件是采用40%飽和度硫酸銨,最佳鹽析條件是采用85%飽和度硫酸銨,用鄰苯三酚自氧化法檢測酶活得到比活力為306.29 U/mg的Mn-SOD,且在60 ℃保溫30 min仍能保留80%的酶活,在pH6～9的條件下仍能表現較高的酶活,具有很好的穩定性。武金霞等[15]采用硫酸銨分級鹽析、離子交換柱層析、分子篩柱層析分離純化,得到雙孢蘑菇子實體Mn-SOD,其分子量為43 kDa,亞基分子量為21 kDa,鄰苯三酚自氧化法檢測酶活酶活高達5512.6 U/mg。可以看出,直接從微生物菌體分離得到Mn-SOD主要采用硫酸銨分級沉淀等方法。除此之外,陸玲等[16]以金針菇液體發酵菌絲為材料,用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳及抑制劑處理法,得到比活力為120 U/mL的Mn-SOD粗酶液,為分離提取MnSOD提供了一種新的方法思路。

以微生物為原材料較為廉價,相比動植物來源的Mn-SOD,由微生物中獲取的Mn-SOD活性較高[15],且對外界環境有著良好的耐受性[14],在工業應用上前景較好。

1.4 利用基因工程菌提取Mn-SOD

近年來,隨著科技發展,構建基因工程菌生產Mn-SOD已成為國內外的研究熱點。利用基因工程菌提取Mn-SOD發展迅速,研究成果較多,該方法主要是首先通過PCR等方法獲得動物[17-19]、植物[20-21]和微生物細胞[22-25]的Mn-SOD基因,然后構建重組質粒,轉移至畢赤酵母、大腸桿菌或乳酸乳球菌等目標菌體中表達。利用基因工程菌產Mn-SOD具有產出快、產量高的優點,是動植物提取法所無法比擬的。

1.4.1 動物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 直接從動物組織提取MnSOD,產率低、產出慢,因此不少學者利用基因工程手段,獲得動物基因表達的Mn-SOD。張慶利等[17]采用PCR方法擴增編碼中國明對蝦線粒體Mn-SOD成熟肽的基因,并克隆到大腸桿菌表達載體中進行體外重組表達,將所得重組蛋白通過金屬鰲合柱進行純化,進而透析、復性,獲得了活性高達2373 U/mg的重組蛋白。凌敏等[18]以人肝細胞株(L02)總RNA為模板,用RT-PCR擴增出人Mn-SOD cDNA,構建重組質粒并轉化至大腸桿菌BL21,獲得了產Mn-SOD的重組蛋白菌株,其酶活達216.13 U/mg。而王峰等[19]以小鼠肝臟cDNA為模板,利用PCR方法克隆小鼠Mn-SOD基因,PCR擴增了1個長600 bp左右的基因片段,將其插入pET15b載體中,將重組質粒轉化至大腸桿菌Rosetta-gami,獲得Mn-SOD比活力為531.7 U/mg的工程菌。

可以發現,與直接從動物組織中獲取MnSOD,通過重組動物來源的MnSOD基因在基因工程菌中表達得到的MnSOD,酶活較高[17],且能利用基因工程菌大量表達獲取高產量的動物來源的Mn-SOD。

1.4.2 植物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 由于提取植物中Mn-SOD工藝相對復雜,一些學者導入植物來源的Mn-SOD到基因工程菌中,通過基因工程菌表達提取植物源MnSOD。馬紅丹等[20]將克隆的大豆Mn-SOD基因開放閱讀框序列重組到經改造的質粒pNZS上,分泌表達載體pNZS-SOD,以電穿孔法轉化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,獲得能夠分泌表達外源Mn-SOD的基因工程菌。徐龍等[21]以茄子葉片cDNA為模板,擴增出帶有SpeI和BglII酶切位點的ORF全長,然后分別用內切酶SpeI和BglII酶切擴增產物Mn-SOD基因和pCAMBIA 1302植物表達載體,回收酶切產物并用T4 DNA連接酶在4 ℃條件下連接6 h,獲得轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,其所編碼蛋白的分子量為25.63 kDa。

通常在植物組織中富含有機酸、維生素、微量元素及酚類和黃酮類物質,在提取Mn-SOD的過程中會導致酶活性的部分喪失。而通過重組植物來源的Mn-SOD基因在基因工程菌中表達提取Mn-SOD,能很好避免這一問題。

1.4.3 微生物來源的Mn-SOD基因在細胞中的表達 不僅是動物植物,一些研究者也對微生物Mn-SOD基因進行克隆表達。張麗青等[22]通過克隆嗜熱毛殼菌錳超氧化物歧化酶基因,進行畢赤酵母真核表達,獲得重組菌株,并純化重組蛋白,該工程菌酶活力達906.23 U/mL;該重組酶的最適反應溫度為60 ℃,最適pH為6.0;在70 ℃的條件下保溫30 min后仍具有71%的酶活力。趙怡[23]以枯草芽孢桿菌ATCC 9372基因組為模板,PCR擴增獲得Mn-SOD基因,并在大腸桿菌BL21中首次成功表達。該研究得到的蛋白分子量約為26 kDa,菌體可溶性總蛋白SOD比活為51.09 U/mg。王黎明等[24]以蠟樣芽孢桿菌M22的Mn-SOD基因構建了畢赤酵母表達質粒pPICZA-Mn-SOD,質粒線性化后通過電激法導入畢赤酵母GS115,得到高拷貝重組菌株,其表達蛋白的相對分子量約為23 kDa。鄧盾等[25]從南海沉積物中分離到一株耐高溫菌Bacillussp. SCSIO 15029,從其基因組中克隆了一個編碼超氧化物歧化酶的基因BaSOD,并在大腸桿菌BL21(DE3)中實現了可溶性異源表達,發現所表達的MnSOD的最適pH為7.5,最適反應溫度為40 ℃,酶活為5511.46 U/mg,具有良好的熱穩定性,在60 ℃處理30 min酶活基本沒有變化,在70 ℃下處理30 min,剩余酶活為71%,具有較好的工業應用前景。

基因工程菌具有生長快、培養周期短的特點,其發酵產品具有高濃度、高轉化率和高產率的優點。與直接從微生物中獲取MnSOD,通過重組微生物來源的MnSOD基因,在基因工程菌中表達提取MnSOD,能有效地縮短MnSOD的產出時間,并提高MnSOD的產量。

2 Mn-SOD的應用

基于Mn-SOD良好的抗氧化和防御疾病等作用,近年來科學工作者在農業[13,26-27]和臨床醫學[28-39]上進行了廣泛的應用研究。

2.1 Mn-SOD在農業上應用的研究

在農業上,研究發現Mn-SOD能夠提高農作物的抗逆性,如抗寒、抗旱、抗鹽害等特性。Bowler C等[26]通過轉基因的方法,使煙草和玉米植株表達Mn-SOD水平提升,發現Mn-SOD在煙草和玉米葉綠體中的過量表達能夠增強轉基因煙草和玉米對質膜的保護作用和對除草劑引起的氧脅迫的耐受性;還有報道稱,杉木在低溫、干旱、鋁、鹽脅迫等逆境條件下均能快速誘導Mn-SOD的表達,并且分別在12、24、48 h達到峰值,且分別是對照組的47.94、3.29、22.21、33.88倍[13]。鄧婷婷[27]用Mn-SOD基因的表達載體轉染SOD缺陷型大腸桿菌并誘導其表達后發現該大腸桿菌在耐鹽、耐輻射和抗寒方面的耐受性均有明顯提高。這些研究發現為Mn-SOD在農業生產上的應用和發展提供了有利依據。

2.2 Mn-SOD在醫學上應用研究

在醫學上,Mn-SOD的應用研究成果頗豐。近年來,有報道稱Mn-SOD在治療高血壓[28]、糖尿病視網膜病變[29]、抗輻射[30]、急性肺損傷[31]、癌癥研究領域[32-38]等方面均有應用。

2.2.1 在治療糖尿病上的應用 糖尿病和高血壓被稱為同源性疾病,兩種疾病無論是病因、互相影響還是危害上都存在共通性,常常合并發作,形成糖尿病高血壓。近年來有報道稱,Mn-SOD能夠在高血壓和糖尿病視網膜病變的治療中發揮作用。如Case等[28]研究發現,在大鼠穹窿下器官中過度表達Mn-SOD可顯著降低血壓,為Mn-SOD在高血壓的臨床治療提供了新的思路。Kanwar等[29]研究發現,線粒體超氧化物歧化酶(Mn-SOD)能對糖尿病視網膜線粒體氧化損傷提供保護,該實驗研究了超氧陰離子和GSH水平對糖尿病的影響,探討錳超氧化物歧化酶在小鼠體內表達Mn-SOD和視網膜線粒體氧化應激反應,證實了糖尿病視網膜病變的發病與錳超氧化物歧化酶的相關作用。這些研究為Mn-SOD治療糖尿病提供了新思路。

2.2.2 在癌癥上的應用 Oberley[30]提出細胞癌變假設,認為正常細胞超氧陰離子生成與Mn-SOD活性保持動態平衡;其研究發現,Mn-SOD的活性與癌癥的發生有著密切的關系。

2.2.2.1 在前列腺癌上的應用 王明臣等[31]分析了Mn-SOD基因在前列腺癌(PCa)及良性前列腺增生(BPH)組織中的mRNA表達情況,揭示了氧化應激損傷在PCa發生過程中的作用,證明了Mn-SOD基因表達低下導致的氧化應激加劇可能在前列腺癌的發生中起著重要作用。

2.2.2.2 在腎癌上的應用 在腎癌的研究領域,Zhao等[32]報道了應用數據依賴的液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)方法對腎癌細胞(Rcc)進行氧化修飾,通過本體分類、相互作用網絡和Western blotting分析表明,腎癌細胞介導的蛋白質與Mn-SODn密切相關。當Mn-SOD表達水平正常時,癌組織相對的Mn-SOD酶活性降低,提示腎癌組織中Mn-SOD酶活性因修飾而受損。同時,Zhao等[33]還對Mn-SOD在透明細胞癌(CcRCC)組織中的表達情況進行研究,研究結果顯示透明細胞腎細胞癌中Mn-SOD mRNA的表達高于正常組織,且Mn-SOD蛋白的表達與正常腎細胞癌的表達呈負相關;并且發現,低Mn-SOD表達與腫瘤特異性生存預后較差有關。這些發現表明,MnSOD是腎透明細胞癌的一個有前景的預后指標,提示氧化應激可能參與了腫瘤的發生和發展。

2.2.2.3 在骨癌上的應用 樓列名等[34]探討了錳型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因轉染對人骨肉瘤細胞的誘導凋亡作用,采用電穿孔方法將反義和正義Mn-SOD cDNA表達載體穩定轉染OS-732骨肉瘤細胞,發現轉染Mn-SOD質粒可誘導OS-732細胞凋亡,研究結果表明,Mn-SOD有望成為新的骨肉瘤細胞抑制劑。

2.2.2.4 在其他癌癥上的應用 田剛等[35]利用同源重組的方法在痘苗病毒VG9的中插入Mn-SOD基因,構建出重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并將重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分別轉染人胃癌細胞株7901;轉染后發現,MnSOD蛋白可在胃癌細胞中呈高表達,且重組溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD對胃癌細胞具有明顯的殺傷作用。研究表明,MnSOD能夠通過誘導細胞凋亡來產生抗癌作用的。此外,Zhang等[36]發現Mn-SOD表達對溶瘤腺病毒有抑制作用,Mn-SOD是結直腸癌患者最有效的輔助治療。

2.2.3 在其他疾病研究上的應用 在其他的疾病防御上,研究表明Mn-SOD有著重要作用。例如,郭洪亮等[37]應用復制缺陷型單純皰疹病毒(HSV)作為錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和綠色熒光蛋白(GFP)基因載體轉染小鼠小腸上皮實驗,結果表明Mn-SOD的過度表達具有顯著的放射性保護作用。Arcaroli等[38]發現,細胞外SOD是一種強有力的抗氧化劑,在控制氧化劑介導的應激和炎癥中起著重要的作用,急性肺損傷在感染患者中經常發生,而在內毒素誘導的急性肺損傷動物模型中Mn-SOD水平對肺損傷的嚴重程度有明顯的調節作用。

3 結語與展望

本文介紹了從動植物、微生物以及基因工程菌中分離獲取Mn-SOD及其應用研究。Mn-SOD作為一種氧化還原酶,常存在于真核細胞的線粒體和原核生物中,最早獲取Mn-SOD的方法就是主要是從動物的肌肉肝臟和植物的葉片中直接提取得到Mn-SOD。這類獲取Mn-SOD的方法操作簡單,工藝條件成熟,但是存在著產率較低和活性較低的缺點。而通過發酵培養微生物,得到大量菌體,再進行提取純化,提取得到Mn-SOD產品,產出快,產量高,極好地克服了動植物直接提取法的缺點。

近幾年,隨著現代生物技術的快速發展,Mn-SOD已大多由原來的動植物提取過渡到基因工程技術來生產,產率與活性得到進一步提高。傳統的Mn-SOD穩定性較差,很難在商品中長期保存。而利用基因工程菌得到耐熱性較高的Mn-SOD,解決了其穩定性問題,也為今后Mn-SOD的開發提供了新思路。此外,國內外在Mn-SOD的應用等方面的研究報道頗多。尤其是在醫學研究領域,其用于疾病機理的研究及診斷已成為當前的研究熱點。這也表明,Mn-SOD在醫學研究上有著其良好的特性。隨著研究的深入,利用基因工程菌生產Mn-SOD逐步實現產業化,相信其在藥品、食品等領域可以發揮巨大的潛力。