熔解曲線結合RT-PCR在餐飲食品中對5種致病菌的檢測

（嘉興市食品藥品檢驗檢測院，浙江嘉興314050）

近年來，以門店形式現制現售的食品越來越受到年輕人的喜愛，包括外賣、飲料、甜品等。但是，由于現制食品涉及到的原料新鮮度、保存條件及現場制作的環境、保藏條件、保存時間及人員操作等均對最終產品具有潛在的病原微生物污染風險。該類食品現制現售、流通較快，對微生物檢驗數據出具的時間要求較為緊迫。目前，對于食品中微生物檢測主要采用GB 4789系列標準，而且我國尚未對現制現售食品發布相關檢驗標準，采用傳統微生物檢測方法，步驟涉及分離、純化、生化鑒定等，方法上顯得冗長，時間上顯得滯后，不利于安全監管，也不利于應對大型集會及突發性食品安全事件。

目前，檢測微生物的方法主要有常規培養法、核酸探針法、聚合酶鏈反應法（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯免疫分析法、單克隆抗體檢測技術、免疫磁珠富集技術、快速測試片法、免疫磁球法、基因芯片法等[1-2]，而其中的PCR技術在微生物檢測方面近年來得到廣泛應用，這使得病原微生物的快速檢測得以實現。

研究人員利用PCR技術進行單重病原微生物檢測，如用PCR擴增沙門氏菌的hilA基因快速檢測沙門氏菌[3]；用PCR技術能檢測牡蠣中1 CFU/g～10 CFU/g的沙門氏菌[4]、雞皮中自帶空腸彎曲菌[5]檢測、通過擴增金黃色葡萄球菌的nuc基因，可以從牛奶中檢測出金葡菌[6]、采用環介導等溫擴增法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法檢測大腸桿菌 O157：H7[7]等。利用多重PCR技術的檢測也有廣泛應用，利用基因芯片實現肉中常見食源性致病菌的多重檢測，方法準確、快速、高敏感性[8]；以沙門氏菌（invA）、單增李斯特菌（hlyA）、金黃色葡萄球菌（nuc）和腸出血性大腸桿菌O157：H7（rfbE）為靶基因設計引物，研究多重檢測致病菌的檢測方法[9-13]；利用多重熒光定量PCR-探針法檢測高致病性沙門氏菌血清型[14]等。

在我國，根據GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》的要求，食品檢測的主要致病菌為沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7和副溶血性弧菌。目前，利用PCR技術結合高分辨率熔解曲線的檢測方法針對該5種致病菌報道較少，因此，試驗以該5種致病菌為研究對象，以門店現制現售的果蔬飲料為基質，結合病原微生物增菌時間，建立快速檢測餐飲食品中5種致病菌的方法體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

采用的菌株均采購自美國菌種保藏中心（American Type Conservation Center，ATCC），詳見表 1。

1.1.2 主要試劑

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陸橋技術股份有限公司；熒光定量PCR預混試劑SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）：寶生物工程（大連）有限公司。

表1 菌株名稱及編號Table 1 Name and number of the bacteria

1.1.3 引物

查閱標準，參考SN/T 1689-2007《食品中多種致病菌快速檢測方法PCR法》標準中列出的引物序列，見表2，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 目標菌的引物序列Table 2 Primers of 5 pathogenic bacteria

1.1.4 主要儀器

熒光定量PCR儀（LightCycler 480-Ⅱ）：羅氏診斷產品（上海）有限公司；干式恒溫器（MK-10）：杭州奧盛儀器有限公司；快速混勻器（XK96-A）：江蘇新康醫療器械有限公司；冷凍離心機（Legend Micro 21R）、超微量核酸測定儀（NanoDrop OneC）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；生化培養箱（SPX-400-Ⅱ）：上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病菌梯度培養

在BPW培養液中分別接種5種致病菌，并按照每降低10倍配制細菌稀釋液，將各梯度進行平板計數，結果見表3。并將各梯度細菌稀釋液置36℃溫度下增菌培養，每隔1 h取混勻的增菌液1 mL，提取DNA，進行檢測分析，旨在獲取各目標菌的最短增菌時間，以達到縮短檢測時間的目的。

表3 各稀釋梯度平板計數的菌含量Table 3 The content of 5 pathogenic bacteria in different dilution （CFU/mL）

1.2.2 DNA模板提取

將目標菌接種于果蔬飲料中，振蕩渦旋后取樣提取目標菌DNA。取1 mL樣液加入到1.5 mL滅菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液；隨后加入50 μL滅菌蒸餾水，并用快速混勻器混勻，放入100℃干式恒溫器中裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一滅菌離心管中，該溶液即為DNA提取液。吸取上清液時不能吸到底部沉淀物，測定DNA模板濃度及純度。

1.2.3 RT-PCR體系的建立

根據SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書，配置20 μL的PCR反應體系，其中包含10 μLSYBRPremixEXTaq（TliRNaseHPlus）（2×），0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL 下游引物（10 μmol/L），2 μL DNA（樣品以目標菌DNA為模板，對照以無菌去離子水的模板）。

反應程序為：95℃預變性30 s；以95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延生10 s，擴增40個循環。PCR產物隨后進行熔解曲線分析，熔解程序為：95℃5 s，60℃1 min；然后升溫至95℃（熔解速率為0.11℃/s），最后50℃冷卻。

1.2.4 RT-PCR反應特異性

在RT-PCR反應體系建立的基礎上，分別對表1所示的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌，進行了特異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR體系的建立

在RT-PCR反應時，針對以上5種目標菌特異性引物的退火溫度，在55℃～65℃范圍內進行預試驗，結果表明，5種目標致病菌在退火溫度為58℃時均能夠獲得良好的擴增，且非特異性擴增不明顯，因此PCR試驗選擇58℃作為反應程序的退火溫度，各目標菌梯度稀釋液的熔解曲線峰見圖1～圖5，并計算平均Tm值。

圖1 沙門氏菌的熔解曲線峰Fig.1 The melting curve of Salmonella

由圖1～圖5可知，沙門氏菌的Tm值為87.32℃，金黃色葡萄球菌為79.57℃，大腸埃希氏菌O157：H7為82.24℃，副溶血性弧菌為87.15℃，單核增生李斯特氏菌為82.02℃。可見，5種目標菌的Tm值部分有一定的相似性，尤其是沙門氏菌和副溶血性弧菌，大腸埃希氏菌O157：H7和單核增生李斯特氏菌，重合性較高，在多重RT-PCR反應時可能存在相互影響難以區分。通過進一步試驗也證明了這點，試驗將單重體系中的模板稀釋至相似濃度后，直接混合在一起進行多重RT-PCR反應，熔解曲線重合度較高，不能有效檢測。因此，本試驗采用相同的RT-PCR檢測體系對5種目標菌分別進行檢測。

圖2 金黃色葡萄球菌的熔解曲線峰Fig.2 The melting curve of Staphylococcus aureus

圖3 大腸埃希氏菌O157：H7的熔解曲線峰Fig.3 The melting curve of Escherichia coli O157：H7

圖4 副溶血性弧菌的熔解曲線峰Fig.4 The melting curve of Vibrio Parahemolyticus

圖5 單核增生李斯特氏菌的熔解曲線峰Fig.5 The melting curve of Listeria monocytogenes

2.2 致病菌增菌時間

通過對5種致病菌梯度稀釋液的培養，找到5種致病菌平板計數為個位數、且經培養后采用RT-PCR體系檢測均達到陽性的最短增菌時間，見表4。

表4 5種目標菌達到檢測靈敏度時的增菌時間Table 4 The enrich time of 5 pathogenic bacteria

由表4可知，沙門氏菌、副溶血性弧菌增菌2 h后，即能被檢出，而其余3種菌培養7 h～8 h后，也能被檢出。可見，不同的菌其生長率各不相同，在檢測1種菌時，可針對性地選擇合適的培養時間，以達到提高檢測效率的目的；而在對5種目標菌進行同時檢測時，樣品增菌8 h后進行檢測，能達到或超過檢測靈敏度而被檢出。

2.3 RT-PCR反應靈敏度

隨著菌液稀釋梯度的不斷增加，其Ct值相應增大。通過對5種致病菌的梯度檢測，結合平板計數結果顯示，該方法對沙門氏菌的檢測靈敏度為8.0×10CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2.4×103CFU/mL，單核增生李斯特氏菌為1.3×103CFU/mL，大腸埃希氏菌O157：H7為2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌為 7.4×10 CFU/mL。其平均Ct值范圍在31.04～34.86之間。試驗結果表明，上述RT-PCR反應體系對該5種目標菌的檢測均具有良好的靈敏度。

2.4 RT-PCR反應體系中引物的特異性

本試驗的反應體系中，混合5種致病菌的DNA模板，分別對5組引物進行特異性試驗，5種目標菌的擴增曲線見圖6，熔解曲線峰見圖7。

圖6 5種目標菌Real-time PCR擴增圖譜Fig.6 The Real-time PCR curve of 5 pathogenic bacteria

由圖6、圖7可知，5種目標菌擴增效果較好，Tm值分別為沙門氏菌87.48℃，金黃色葡萄球菌79.47℃，單核增生李斯特氏菌81.68℃，大腸埃希氏菌O157：H7 82.04℃，副溶血性弧菌87.09℃，與2.1試驗結果一致，標準偏差范圍在0.04℃～0.14℃之間，該反應體系中各引物對具有較好的特異性。

圖7 5種目標菌的熔解曲線峰Fig.7 The melting curve of 5 pathogenic bacteria

3 結論

試驗建立了熔解曲線結合RT-PCR快速檢測食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7及副溶血性弧菌5種致病菌的方法體系。通過對培養時間的比較，分別獲得5個目標菌達到檢測靈敏度的最短增菌時間，增菌時間范圍為2h～8h，試驗靈敏度分別為沙門氏菌8.0×10CFU/mL，金黃色葡萄球菌2.4×103CFU/mL，單核增生李斯特氏菌1.3×103CFU/mL，大腸埃希氏菌O157：H7為2.2×103CFU/mL，副溶血性弧菌7.4×10 CFU/mL。5種目標菌的Tm值分別為沙門氏菌87.32℃，金黃色葡萄球菌79.57℃、單核增生李斯特氏菌82.02℃、大腸埃希氏菌O157：H782.24℃、副溶血性弧菌87.15℃。試驗采用水煮法[15]直接提取樣品中的DNA，其操作簡單，提取時間短，DNA純度范圍在1.4～1.8之間，能滿足PCR檢測要求。通過該方法體系的建立，針對以上5種致病菌，檢驗過程簡單方便，與常規微生物檢測方法比較，大大提高了檢測時效性，且該方法的靈敏度、特異性均滿足要求，為實現餐飲食品中微生物的快速檢測提供參考。

試驗發現，由于不同致病菌的生長速率不同，在增菌時間上各有差異，檢測時可根據具體檢測目標菌選擇不同的增菌時間，以縮短檢驗時間。反應體系建立時，退火溫度是關鍵條件，要根據目標菌引物的特性調整退火溫度，使得在相同退火溫度等PCR參數條件下實現同步檢測的目的。另外，簡單地把模板DNA和引物混合起來，由于DNA和引物對之間的相互影響，利用熔解曲線檢測效果并不理想。但試驗建立的反應體系，在僅混合DNA模板而不混合引物時，同時檢測5種目標菌，具有較好的擴增曲線，且引物對的特異性也較好。