響應面法優化超聲波輔助法提取稠李子多酚的工藝研究

齊泊霖，高尊，謝春陽

（吉林農業大學，吉林長春130118）

稠李子，又名臭李子，拉丁學名Rhamnus davurica Pall.，被子植物門，雙子葉植物綱，鼠李科，鼠李種。稠李子主要分布在我國東北部和俄羅斯的西伯利亞地區，朝鮮和蒙古也有少量分布。成熟期為8月～9月，稠李子種子可煉油，果肉可入藥屬于藥食兼備的野生漿果。

稠李子含有植物多酚[1-3]，植物多酚是多羥基酚類化合物的總稱，具有清除自由基、抗氧化、抗輻射、抗過敏、預防人體衰老、降血糖降血脂的作用[4-5]。植物多酚目前應用于食品、藥品、保健品、美容產品、抗氧化劑等各個行業，受到各界學者的青睞[6]。

常見的多酚提取方法有1）溶劑提取：將所選的溶劑加入到待提取的固相或液相中，使其混合，從而將其中一種或多種多酚類物質溶出，這類方法統稱為溶劑萃取法。該方法工藝簡單，但用的溶劑劑量十分大，耗費時間長，操作要求嚴格[7]。2）超聲波輔助法：利用超聲波產生的微氣核、熱效應以及空化效應，使細胞內物質加速釋放，溶解。其優點在于操作簡單快捷，提取時間短，不會破壞提取物的結構[8]。3）生物酶解提取法：選擇相應的纖維素酶、果膠酶進行水解，從而破壞細胞壁結構，加快細胞內成分溶解[9]。4）微波輔助提取法：在微波過程中，微波輻射產生大量熱量，導致細胞壁破壞，從而加速細胞內成分釋放，但缺點是有可能破壞多酚類物質[10]。

本試驗以超聲波輔助法提取稠李子中的多酚，以稠李子多酚的提取量為試驗指標，對超聲時間、超聲功率、液料比、乙醇濃度4個因素進行單因素試驗，在單因素的基礎上選取效果最佳的3個取值，借助試驗設計軟件Design Expert 8.0采用Box-Behnken設計法對影響超聲波輔助法提取稠李子中多酚提取量的4個關鍵因素超聲時間、超聲功率、液料比、乙醇濃度進行優化，建立并驗證相關的工藝數學模型，得出超聲波輔助提取稠李子多酚的最佳的提取工藝，旨在為稠李子多酚提取及稠李子多酚產品的深度開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稠李子：采購于大興安嶺；無水碳酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：北京化工廠；福林-酚試劑：上海荔達生物科技有限公司；沒食子酸（分析純）：天津市光復精細化工廠。

1.2 儀器與設備

SY-1000E超聲波細胞粉碎機：北京弘祥隆生物技術有限公司；T6型紫外分光光度計：上海五相儀器儀表有限公司；HH-4A型號數字顯示恒溫水浴鍋：常州普天儀器；YP4002電子天平：上海佑科儀表有限公司；LXJ-IIB型離心機：上海安亨科學儀器廠；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；LGJ壓蓋型凍干機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制備

本試驗運用福林-酚比色法測定稠李子中的多酚含量。以沒食子酸計，在760 nm處測定吸光值，根據吸光值的大小與沒食子酸濃度的大小成正相關的關系，制作沒食子酸標準曲線[11]。

1.3.2 結果計算

式中：M為稠李子樣品中多酚的含量，mg/g；X為在稠李子多酚含量標準曲線中根據所測吸光值得出的稠李子多酚溶液的質量濃度，μg/mL；m為稠李子樣品的質量，g；V為稠李子樣品定容的體積，mL；A為吸光值；1 000為樣品稀釋倍數[12]。

1.3.3 稠李子粗多酚的提取工藝

洗凈→去核→勻漿→超聲波輔助提取→離心→上清液→濃縮→冷凍→凍干

1.3.4 稠李子多酚提取的單因素試驗

1.3.4.1 超聲時間對稠李子多酚提取量的影響

準確稱取稠李子勻漿10 g，將超聲波功率設定為600 W，溶劑乙醇的濃度固定為50%，液料比的比值固定為 15 ∶1（mL/g），考慮超聲波處理時間為 10、20、30、40、50 min時，對稠李子多酚提取量的影響。

1.3.4.2 超聲功率對稠李子多酚提取量的影響

準確稱取稠李子勻漿10 g，將超聲時間固定為30 min，溶劑乙醇的濃度固定為50%，液料比的比值固定為 15∶1（mL/g），考慮超聲波功率為 200、400、600、800、1 000 W時，對稠李子多酚提取量的影響。

1.3.4.3 液料比對稠李子多酚提取量的影響

準確稱取稠李子勻漿10 g，將超聲時間固定為30 min，超聲波功率設定為600 W，溶劑乙醇的濃度固定為 50%，考慮液料比的比值為5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）時，對稠李子多酚提取量的影響。

1.3.4.4 乙醇濃度對稠李子多酚提取量的影響

準確稱取稠李子勻漿10 g，將超聲時間固定為30 min，超聲波功率設定為600 W，液料比的比值固定為 15∶1（mL/g），考慮溶劑乙醇的濃度為 30%、40%、50%、60%、70%時，對稠李子多酚提取量的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

在上述單因素試驗的基礎上，利用響應面法設計超聲波輔助法提取稠李子多酚的試驗方法，選取超聲時間、超聲功率、液料比、溶劑乙醇濃度為影響稠李子多酚的提取優化的因素，以稠李子多酚提取量（M）作為試驗設計的響應值，借助試驗設計軟件Design Expert（Version8.0），采用 Box-Behnken 設計法，借助四因素三水平的試驗設計方法來確定超聲波輔助法提取稠李子多酚的最佳工藝參數。主要的考察要素（自變量）是：超聲時間、超聲功率、液料比、溶劑乙醇濃度，分別用 A、B、C、D 表示，用-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平。試驗設計因素編碼及水平見表1[13]。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 Variables and levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

采用福林-酚比色法，繪制的沒食子酸標準曲線見圖 1。回歸方程：Y=0.131 7x-0.067 4，R2=0.997 2。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 超聲時間對稠李子多酚提取量的影響

超聲時間對稠李子多酚提取量的影響如圖2所示。

將毛竹不同密度、不同施肥條件下的毛竹胸徑增長率(增長量與未施肥前胸徑比值)進行雙因素方差分析，結果顯示：F密度=0.090，Sig.=0.769；F肥料=2.250，Sig.=0.142。說明在不同密度條件中不同肥料所產生的增長率沒有顯著差異。這與郭志堅研究[2]的結果相似。

圖2 超聲時間對稠李子多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

超聲時間在10 min～40 min之間，稠李子多酚的提取量隨著時間的增加而增加，當超聲時間為40 min時，多酚提取量最高為5.794 mg/g，當超聲時間高于40 min時，稠李子多酚提取量開始有下降的趨勢。超聲時間過長，多酚提取量會受到影響。因此，超聲時間應控制在40 min左右[14]。

2.2.2 超聲功率對稠李子多酚提取量的影響

超聲功率對稠李子多酚提取量的影響如圖3所示。

圖3 超聲功率對稠李子多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

聲功率在200 W～600 W之間時，稠李子多酚提取量逐漸上升，當功率達到600 W時，稠李子多酚提取量達到最大5.665 mg/g。當超聲功率超過600 W時，稠李子多酚提取量會呈大幅度下降趨勢。可能的原因是超聲功率過高，其導致的熱效應與機械效應會使多酚類物質結構被破壞。因此，超聲功率應該控制在600 W左右[15]。

2.2.3 液料比對稠李子多酚提取量的影響

液料比對稠李子多酚提取量的影響如圖4所示。

圖4 液料比對稠李子多酚提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

液料比從 5 ∶1（mL/g）增加到 15 ∶1（mL/g），稠李子多酚提取量有著明顯的提升，當液料比增加到15 ∶1（mL/g）時，多酚提取量達到 5.172 mg/g，稠李子多酚提取量基本趨于平穩，此時再增加液料比稠李子多酚提取量提升效果不顯著（P＞0.05），還會增加提取成本，因此，液料比應控制在 15 ∶1（mL/g）左右[16]。

2.2.4 乙醇濃度對稠李子多酚提取量的影響

乙醇濃度對稠李子多酚提取量的影響如圖5所示。

乙醇濃度在30%～50%之間，稠李子多酚提取量逐漸上升，當乙醇濃度達到50%時，稠李子多酚提取量達到5.624 mg/g，乙醇濃度超過50%后，稠李子多酚提取量增加趨勢不明顯（P＞0.05），基本趨于平穩，并且隨著乙醇濃度的增大，也會使其他雜質溶出，還會增加試驗成本。因此，乙醇濃度應控制在50%左右。

圖5 乙醇濃度對稠李子多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

2.3 響應面法優化結果

2.3.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

通過響應面法設計得出稠李子多酚提取量的數值，如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計與數據分析Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

續表2 Box-Behnken試驗設計與數據分析Continue table 2 Response surface design arrangement and experimental results

方差分析結果見表3。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

通過表3可知F值為28.72，P值＜0.000 1，表示該模型為高度的顯著。從表3的F值可判斷出，各因素對稠李子多酚提取量影響的大小順序依次為：超聲功率＞超聲時間＞乙醇濃度＞液料比[17]。稠李子多酚的提取量，對自變量超聲功率、超聲時間、液料比、乙醇濃度的二次多項回歸方程為：M=6.01-0.69×A+0.40×B+0.20×C+0.15×D+0.24×A×B-0.081×A×C+0.033×A×D-0.034×B×C-0.31×B×D-0.080×C×D-1.15×A2-0.63×B2-0.69×C2-0.59×D2。回歸決定系數R2=0.966 3，校正決定系數R2Adj=0.932 7（0.932 7＞0.80） 以及變異系數（CV）為0.820 0，說明此模型可以解釋其中93.27%變化的響應值，僅有總變異的6.73%變化無法用此模型解釋，則該模型的擬合度較好，具有統計學意義，可以用來對超聲波輔助法提取稠李子多酚的工藝研究進行初步分析和預測，通過響應面法分析后可看出：AB、AC、AD、BC、BD、CD之間的關系不能用簡單的線性關系來描述，此二次多項回歸方程能較好地描述各個自變量與響應值之間的真實關系，最好的提取工藝條件也可以用其來確定。由此得到最優提取工藝為：稠李子多酚的提取量為6.17 mg/g；最優的超聲波處理功率為554.1 W，超聲波處理時間為42.4 min，液料比為15.2 ∶1（mL/g），乙醇濃度為 51.5%[18]。

2.3.2 稠李子多酚提取量的響應面分析

利用Design Expert（Version8.0）軟件，得到相應的二次回歸方程的等高線及其響應面圖。根據模型所做的響應曲面及其相應的等高線圖可評估試驗因素對稠李子多酚提取量的互相作用，以及確定每個自變量的最優水平范圍。交互效應的強弱可由等高線的形狀反映，若兩因素交互作用顯著則顯示為橢圓形，若表示成圓形，則兩因素交互作用可忽略[19]。超聲功率與超聲時間交互作用對稠李子多酚提取量的影響結果見圖6。

圖6 超聲功率與超聲時間交互作用對稠李子多酚提取量的影響Fig.6 Effect of iltrasonic power value of interaction with the iltrasonic time on the yiled of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

由圖6可以看出，超聲波功率與超聲波處理時間的相互作用，對稠李子多酚提取量的影響，當超聲波功率與超聲波處理時間超過一定值時，稠李子多酚的提取量會有所下降，可能是由于較高的超聲波功率和長時間的超聲波處理時間會對已經溶出多酚類物質的結構產生破壞，從而使稠李子多酚的提取量下降。由表3可知AB的P值小于0.05，為顯著水平，說明AB的交互作用對多酚的提取量有著較為重要的影響[20]。

液料比與超聲時間交互作用對稠李子多酚提取量的影響見圖7。

圖7 液料比與超聲時間交互作用對稠李子多酚提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-to-solid ratio value of interaction with the iltrasonic time on the yiled of polyphenols from Rhamnus davurica Pall.

由圖7可以看出，液料比與超聲波處理時間的相互作用會對稠李子多酚的提取量產生影響，當液料比與超聲波處理時間超過一定值時，會使稠李子多酚的提取量會下降，由于較高的液料比會使稠李子中的雜質溶出，并且長時間的超聲波處理時間會對已經溶出多酚類物質的結構產生破壞，從而使稠李子多酚的提取量下降。由表3可知BD的P值小于0.05，為顯著水平，說明BD的交互作用對多酚的提取量有著較為重要的影響。

根據Design Expert（Version8.0）軟件所提供的預測提取工藝參數為超聲時間42.4 min，超聲功率544.1 W，液料比 15.2 ∶1（mL/g），乙醇濃度為 51.5%，稠李子的多酚提取量為6.27 mg/g，但考慮試驗儀器實際情況，故將超聲時間調整為43 min，超聲功率為550 W，液料比為15∶1（mL/g），乙醇濃度為52%，在此條件下進行3次重復試驗，稠李子多酚提取量為（6.23±0.18）mg/g，與預測值基本吻合，說明在此4個條件下的模型對于稠李子多酚提取量能夠進行較準確的分析，該優化工藝條件較為可靠。

3 結論

本試驗應用超聲波輔助法提取稠李子多酚，以稠李子多酚提取量為試驗指標，得出超聲波輔助法提取稠李子多酚的最佳條件為：超聲時間43 min，超聲功率為550 W，液料比為15∶1（mL/g），乙醇濃度為52%，稠李子多酚提取量為（6.23±0.18）mg/g。