熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖工藝研究

鄭婷婷，張文杰，嚴亮，龔婉瑩，王雪峰，廖國周，谷大海，范江平，*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201；2.普洱茶研究院，云南普洱665000）

多糖（polysaccharide）是由10個及以上單糖通過糖苷鍵形成的多羥基醛酮類的高分子聚合物。多糖的來源廣泛，主要來源于高等光合植物、真菌、藻類、細菌等，與蛋白質、脂質、核酸一起被視為生物體內重要的4種生物大分子物質[1]。現代研究表明，多糖具有抗氧化、抗輻射、降血糖、抗腫瘤、調節免疫等多種生物活性，由于藥用真菌多糖及食用菌多糖具有顯著的免疫調節作用和抗腫瘤活性，因此可作為營養保健品及治療藥物的重要來源[2-3]。

黃皮疣柄牛肝菌[Leccinum crocipodium（Letellier.）Watliag]，滇中稱為黃癩頭，屬真菌界（Fungi），擔子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Boletaceae），疣柄牛肝菌屬（Leccinellum）。夏秋季生闊葉林下，分布廣泛，屬樹木外生菌根菌[4-5]。研究表明，黃皮疣柄牛肝菌含有豐富的蛋白質，粗纖維、礦物質等營養成分及多酚、多糖等生物活性成分[6]。目前對黃皮疣柄牛肝菌的研究主要集中在營養成分的分析及多酚生物活性的研究[7]，對黃皮疣柄牛肝菌多糖的研究較少。多糖的提取方法較多，熱水提取法作為多糖提取最常規的方法之一，具有設備簡單，易于操作，成本低廉且對天然活性物質結構影響較小等優點。因此，本試驗采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法進行優化，得出最佳提取工藝條件，以期為黃皮疣柄牛肝菌多糖活性的深入研究及其開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃皮疣柄牛肝菌：云南易門康源菌業有限公司；葡萄糖：天津市致遠化學試劑有限公司；苯酚：天津市風船化學試劑科技有限公司；濃硫酸：云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HWS28型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-2450型紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；FW135型粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；FST-PF-UP普利菲爾實驗室超純水機：上海富詩特儀器設備有限公司；Mettler-Toledo MS104TS分析天平：上海微川精密儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖

鮮菌除雜清洗—切片—冷凍干燥—打粉—過80目篩—備用。取0.5 g粉末，以去離子水為溶劑，以一定的液料比、提取溫度和提取時間熱水提取黃皮疣柄牛肝菌多糖。提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清，采用苯酚硫酸法測定多糖含量，計算提取率。

1.3.2 葡萄糖標準曲線繪制

配置濃度為100 μg/mL的葡萄糖標準溶液，分別吸取葡萄糖標準溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于 25 mL比色管中，分別補水至1 mL，然后加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水作為空白對照，在490 nm波長下測吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.009 6x-0.003 5，R2=0.999 8。

1.3.3 黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率測定

取1 mL上清液定容于100 mL容量瓶，精確吸取1 mL溶液于比色管，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水作為空白對照，在490 nm處用分光光度計測量吸光度。根據葡萄糖標準曲線方程計算多糖提取率。計算公式如下：

多糖提取率/%=[（C×V×N）×10-3/m]×100

式中：C為測得的多糖溶液濃度，μg/mL；V為多糖溶液測定體積，mL；N為樣品稀釋倍數；m為樣品質量，mg。

1.3.4 熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖單因素試驗

在熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖的過程中，影響多糖提取率最重要的因素為液料比、提取溫度、提取時間。本試驗中，考察提取溫度 40、50、60、70、80 ℃；液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）；提取時間1、2、3、4、5 h對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.3.5 響應面優化最佳提取工藝

響應面試驗設計[8-9]：依照單因素試驗結果，通過Design-Exert8.0.6軟件，采用Box-henhnken中心組合試驗設計，采用三因素三水平響應面分析法測定不同參數對響應值Y—多糖提取率（%）的影響，以確定最優提取條件。因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素水平編碼表Table 1 Response surface analysis factor level coding table

1.3.6 數據處理

本試驗設計采用Design-Exert8.0.6軟件，圖形制作采用GraphPad Prism 5軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

固定液料比為 30 ∶1（mL/g）、提取時間 3 h，考察提取溫度對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，在40℃～50℃范圍內，隨著溫度的升高多糖的提取率逐漸增加，當溫度達到50℃時，多糖的提取率最高，當溫度超過50℃后，多糖的提取率開始下降。這是由于黃皮疣柄牛肝菌多糖對高溫較敏感，用較高的溫度浸提破壞了多糖的結構，造成多糖提取率下降。因此，適宜的提取溫度為50℃左右。

2.1.2 液料比對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

液料比對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響結果如圖2所示。

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

圖2 液料比對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖 2 可知，當液料比在 10∶1（mL/g）至 30∶1（mL/g）時，多糖提取率隨液料比的升高而升高。而當液料比超過30∶1（mL/g）時多糖提取率呈下降趨勢，這可能是因為溶劑少時，多糖不能充分溶出導致提取率偏低，溶劑增加有利于多糖的溶出，但是過多的溶劑會增加后續蒸發濃縮時間，造成多糖損失[10-11]，因此選擇 30 ∶1（mL/g）的液料比較為合適。

2.1.3 提取時間對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

提取時間對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響結果見圖3。

由圖3可知，在一定范圍內，隨著時間的延長多糖提取率表現為先增大后減小，提取時間為3 h時，多糖的提取率最高。這是因為短時間的提取不利于多糖的充分溶解，從而導致提取率較低，長時間的提取易使多糖降解導致提取率下降。因此，選擇最適提取時間為3 h。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.2 響應面優化黃皮疣柄牛肝菌多糖提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果

運用Design-Exert8.0.6軟件，采用Box-henhnken中心組合試驗設計原理，依據單因素試驗結果，選取提取溫度、液料比、提取時間3個對多糖提取率影響較大的因素，采用三因素三水平響應面分析法，確定最佳提取工藝。響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of response surface

2.2.2 回歸模型建立與方差分析

運用Design-expert軟件對表2中的試驗結果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型。獲得熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖提取溫度（A）、液料比（B）和提取時間（C）與多糖提取率（Y）的二次多項回歸方程為：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The table of regression model variance analysis

結合表3，可判斷回歸方程中各個自變量對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響。由表3可知，模型相關系數R2=0.967 1，調整決定系數R2Adj=0.908 0，表明該模型擬合程度良好[12]。失擬項P＞0.05，說明實測值與預測值之間無失擬存在，說明該數字模型具有較好的預測性，可用于分析和預測黃皮疣柄牛肝菌多糖最佳提取條件。由F值的大小可以判斷，各因素對多糖提取率影響大小為：液料比＞提取時間＞提取溫度。

2.2.3 響應曲面分析

響應面圖形是響應值Y與對應的因素構成的一個三維空間在二維平面上的等高線圖，響應面圖形分析是將一個因素固定在零水平，對其中另外兩個因素進行分析。通過響應面圖形可以直觀看出各因素對響應值Y的影響[13-14]。各因素交互作用對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率影響的響應曲面圖見圖4。

如圖4，由溫度和液料比兩者的交互作用可知，當溫度不變時，黃皮疣柄牛肝菌多糖的提取率隨著液料比的增大先上升后下降，當液料比不變時，多糖提取率隨著溫度的升高先上升后下降。

由時間和溫度兩者的交互作用可知，溫度不變時，隨著時間的延長，多糖提取率逐漸上升，之后表現為下降。在提取過程中過高的溫度和過長的提取時間會導致多糖的降解，從而影響多糖的提取率[15]。因此，在多糖的提取過程中溫度不宜過高時間不宜過長。

圖4 各因素交互作用對多糖提取率影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface diagram of the effect of various factors on the extraction rate of polysaccharides

由液料比和提取時間的交互作用可知，時間一定時，隨著液料比的增加多糖提取率表現為先上升后下降，說明適宜的液料比升溫快，細胞壁易破裂使多糖溶出。而液料比增加，一定時間內多糖不能完全溶出，多糖提取率反而降低。因此，熱水法提取多糖需要適宜的液料比和提取時間。

2.2.4 最優工藝參數確定

運用Design-expert軟件分析得到最大提取率（Y）時，與其對應的黃皮疣柄牛肝菌多糖的最佳提取條件為液料比33.41∶1（mL/g），提取溫度50.73℃、提取時間3.08 h，此條件下多糖提取率理論值為16.91%。采取最佳提取條件驗證試驗結果，根據試驗條件，優化工藝條件為液料比34∶1（mL/g），提取溫度51℃，提取時間3.1 h，測得3次驗證試驗結果平均值為16.67%，與理論值接近。因此，響應面優化得到的黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率工藝參數是可行的。

3 結論

本試驗以黃皮疣柄牛肝菌為原料，采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖，考察料液比、提取溫度和提取時間對黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，通過響應面優化得到熱水提取法最佳工藝參數為：液料比34∶1（mL/g），提取溫度51℃，提取時間3.1 h。該方法操作簡單，提取率高，且避免了高溫提取對多糖結構的破壞，易于對后續黃皮疣柄牛肝菌多糖的分離純化、結構鑒定及生物活性研究奠定一定的試驗基礎。