水產品中特定腐敗菌分析技術的研究進展

邢家溧，徐曉蓉，丁源，鄭睿行，*，張書芬，李湘江，沈堅，李和生，*

（1.寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波315000；2.寧波大學，浙江寧波315211）

近年來，隨著人們生活水平的提高，人們的飲食習慣呈現出多元化的趨勢，從之前的單一飲食品種逐漸改變為現在的飲食品種多樣化，水產品在我國國民的膳食占比中的比例正在不斷增加[1]。除此之外，由于我國在近幾年來已經成為了世界水產品養殖和貿易出口大國，水產品的養殖產量占全世界的70%，其出口額已連續6年位居世界第一[2]，其產量已經連續24年位居世界第一[3]。水產品不僅擁有豐富的營養優質蛋白，同時還具有比較鮮美的味覺享受，因此其備受消費者們的青睞[4]。由于目前我國居民的人均收入在不斷的提高，所以人們對健康的生活理念也越來越看重，更多的消費者已經越來越重視食品的質量安全問題[5]。但是新鮮的水產品中往往因為含有較多的水分、可溶性蛋白質和不飽和脂肪酸而容易氧化，再加上目前水產品保藏保鮮技術還不夠完善等問題，使得水產品相比于其他一般的動物肉制品更容易腐敗變質[6]，從而會對經濟造成較大的損失，引起不必要的浪費[7-8]。除此以外，微生物也是大多數水產品腐敗的主要原因，從而縮短水產品的貨架期，如果能在水產品的貯藏過程中對其特定腐敗菌進行控制即可有效延長貨架期[9]。水產品中優勢腐敗菌種類一般與水產品類別有關，不同類別之間存在較大差異，因此僅依靠傳統培養鑒定微生物的方法對于大批量研究水產品優勢菌并不合理。所以，對水產品特定腐敗菌的分析技術進行研究顯得尤為必要。這不僅能為水產品中優勢菌的研究提供技術支持，也能提高水產品優勢菌研究的效率，具有一定的經濟效益。目前，國內外研究水產品優勢菌的技術主要有基因組指紋（polymerase chain reaction-repetitive extra-genic palindromic，Rep-PCR）分析技術、聚合酶鏈反應變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析技術、聚合酶鏈反應溫度梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-temperature gradient gel electrophoresis，PCR-TGGE） 分析技術、聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）分析技術和高通量測序，本文就這幾種技術的應用現狀及各自存在的優缺點進行綜述，以期為水產品的優勢菌研究提供一定的參考作用。

1 特定腐敗菌

1.1 特定腐敗菌的概念及特征

20世紀末特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）的概念被首次提出，國外研究人員[10-13]對造成水產品品質下降的微生物進行研究后，發現不同的水產品含有的菌相是有差異的，并且起腐敗作用的菌類也并非是水產品含有的所有微生物。研究表明，引起水產品腐敗的微生物只是所含有微生物中的某幾類在參與腐敗的過程，這就是該水產品的特定腐敗菌[14]。Dalgaard等[15]認為食品的種類不同，其所受的環境影響因子也不同，這意味著只有適合該環境條件的特定腐敗菌才會比其他微生物更容易生長，在水產品的腐敗過程中不僅能夠逐漸占據優勢地位，還具有較強腐敗活性，從而加快水產品的腐敗。特定的微生物針對特定食品的腐敗，即該食品特定的腐敗微生物[16]。水產品腐敗變質的主要表現為其攜帶的特定致腐微生物在生長和代謝過程中生成了一些不良物質，從而使得水產品在感官上出現了不被消費者所接受的氣味、觸感和色澤，這些物質主要包括會產生異味的胺類、硫化物、有機酸等[17]。

1.2 水產品中的特定腐敗菌

新鮮水產品中的特定腐敗菌，其含有的細菌總數在貯藏前期所占的比例并不大，但是在貯藏過程中會由于SSO適應了所處的環境，細菌數目會隨貯藏時間的延長而增加，直至細菌對數增長期的出現，以至于在貯藏的中后期水產品中的菌落總數呈迅速增加狀態[18]。不同的水產品中含有不同的SSO，有試驗結果表明，造成新鮮水產品腐敗的SSO主要是附于其表面的腐敗微生物，這類微生物多為水產品捕撈之前所處環境中存在的細菌，其中淡水環境中主要包括黃綠假單胞菌、桿菌、棒狀桿菌、黃桿菌、芽孢桿菌和沙雷氏菌等；海水產品含有的腐敗菌主要為假單胞菌、無色桿菌、黃桿菌、弧菌、腸桿菌等[19]，但是一般情況下，處于相同環境中的同種水產品含有的特定腐敗菌也許只存在一種。

水產品經捕撈上岸后，為了保證其新鮮度通常都會被貯藏在溫度較低的環境中，通過早前的研究發現，低溫貯藏水產品的腐敗菌主要有：磷發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）等[20-21]。這幾種細菌都屬于革蘭氏陰性桿菌，其中腐敗希瓦氏菌和磷發光桿菌都具備將氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO） 還原成三甲胺（trimetlylamine，TMA）的能力，導致水產品出現魚腥惡臭味[6]。一些水產品可能只含有其中的一種SSO，不同棲息水域的不同的水產品所含有的特定腐敗菌種類可能存在較大差異。

2 水產品特定腐敗菌分析技術的研究

微生物群落多樣性由物種多樣性、遺傳多樣性和功能多樣性組成[22]。其中遺傳多樣性是研究微生物類別的重要關鍵點。由于細菌的16S核糖體脫氧核糖核酸（16S ribosome deoxyribonucleic acid，16SrDNA）的保守區具備共通性，因此可用于設計通用引物。此外，其可變區的特異性可用來鑒別菌種種類。換言之，16SrDNA是樣品總細菌群落結構分析的分子基礎。所以采用16SrDNA作為目的序列對各樣品中的微生物進行結構分析、鑒定和比對是較為快速與簡便的方法[23]。16S核糖體核糖核酸（16S ribosome ribonucleic acid，16SrRNA）基因存在于所有的細菌中，功能同源并且分子大小適宜操作，序列變化與進化距離相等，在系統進化中既高度保守又有可變性，這些特點使其在細菌鑒定、分類和菌落多樣性的研究中被廣泛應用[24]。由于16SrRNA和16SrDNA的保守性和特異性，隨著聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的發展，兩者相互促進成為在微生物多樣性的研究中常用來作為物種鑒定的重要手段[9]。

2.1 Rep-PCR指紋分析技術

近年來利用細菌基因組指紋分析方法，即細菌基因組重復序列PCR技術（repetitive extra-genic palindromic，Rep-PCR）擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復序列，通過瓊脂糖電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差別[9]。Rep-PCR可以采用多種引物進行擴增[25-27]，與擴增序列進行比對，聚類分析其指紋數據，用來擴充菌株指紋圖譜。如大腸埃希氏菌[9]（E.coli）[28]、嗜糞紅球菌（Rhodococcus coprophilus）和脆弱擬桿菌HSP40噬菌體（Bacteroides fragilis HSP40 phages）[29]，雙歧桿菌屬[30]（Bifidobacterium spp）、產氣莢膜梭菌[31-33]（Clostridium perfringens），F+RNA 糞便大腸桿菌噬菌體（faecali+RNA coliphages，F+RNA coliphages）[34]并結合微生物源示蹤技術（microbial source tracking，MST）[35-36]，已演變為檢測細菌的一種重要分子技術。Lin C W等[37]利用脈沖場凝膠電泳（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）和3種簡單的Rep-PCR方法[即腸細菌重復基因間共有序列 PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR），以BOX插入因子（細菌基因組重復序列）為基礎的PCR技術BOX-PCR和重復基因外回文PCR（Rep-PCR）對評估20株嗜麥芽窄食單胞菌分離株遺傳相關性進行了比較。在該研究中發現，與PFGE相比，ERIC-PCR表現出較低的區分能力，但是BOX-PCR與Rep-PCR對近親遺傳相關的分離物具有比較明顯的區分程度。這表明BOX-PCR與Rep-PCR是評估嗜麥芽窄食單胞菌分離菌株遺傳相關性較為簡單便捷的方法，該研究為探索嗜麥芽窄食單胞菌的流行病學提供了更為簡便的分析技術。Mohammadjavad Paydar[38]等利用Rep-PCR分析技術對采購于馬來西亞不同地點的150份海鮮樣本的副溶血性弧菌分離株進行了分析，這些海鮮樣品包括魚、小蝦、明蝦、蜊、牡蠣、蛤和烏賊。試驗結果表明，使用Rep-PCR技術來表征副溶血性弧菌分離株可以觀察到41個Rep譜，并且所有分離株在80%的相似性下被分類為11個不同的簇，該研究中副溶血性弧菌的DNA指紋圖譜顯示了分離株間的高度遺傳多樣性，并且Rep-PCR能夠區分具有不同病毒型的分離株。這表明Rep-PCR技術不僅可以用來區分不同分離株的細菌，還可以用來區分不同病毒型的分離株，并且操作方法相對來說較為簡便，可以為水產品特定腐敗菌分離菌株的研究提供一定的參考價值。

2.2PCR-DGGE和PCR-TGGE分析技術

基因指紋技術還包括變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和溫度梯度凝膠電泳[39]（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），其原理是利用DNA雙螺旋結構的特異性和穩定性結合變性聚丙烯酞胺凝膠電泳方法來分析細菌16SrDNA片斷擴增產物，分析微生物區系多樣性與優勢性[40]。DGGE技術雖然從發明[41]到首次應用之間經歷了短短幾十年[42]，但其在微生物群落的多樣性和種群差異性的檢測方面都有著十分顯著的優勢。單獨采用聚丙烯酞胺凝膠電泳只能依據雙鏈DNA分子的正負性分離出差別較明顯的條帶，但片段長短相同，堿基排列順序不同的DNA分子卻無法被辨別，這就為鑒別微生物群落多樣性造成諸多不便。但考慮到DGGE/TGGE技術因為加入了一定量的變性試劑，例如：尿素和去離子甲酞胺或者是設置一系列的溫度梯度，以此就能達到把相同大小片段但堿基組成不同的DNA片段區分開的目的。這是由于不同細菌的DNA片段有其特定的DNA解鏈區域及解鏈規律[43-44]。DGGE的方法己經成功應用于對養殖雜色鮑腸道微生物菌群的分析中[45]。如比較健康鮑腸道和病鮑腸道微生物組成和差異的研究中比較分析4個成長階段中雜色鮑腸道微生物組成和差異[46]。張新林等[47]利用PCR-DGGE技術對三文魚在冷鏈貯運4℃條件下的腐敗機制，通過DGGE指紋圖譜顯示，三文魚在貯藏期間微生物多樣性逐漸降低，通過分析得知假單胞菌屬和希瓦氏菌在貯藏過程中漸漸成為優勢腐敗菌。該試驗結果表明通過PCRDGGE技術可以確定4℃三文魚的特定優勢腐敗菌。王慧敏等[48]利用PCR-DGGE分析技術和傳統菌落計數方法對處于微凍和冷藏環境中的鱸魚的優勢腐敗菌進行了分析對比。從DGGE圖譜和菌落計數中都表明，鱸魚在上述兩種環境中產H2S菌和假單胞菌都呈現出最快的增長速率，并且發現鱸魚的SSO為腐敗希瓦氏菌和假單胞菌。由此可見，PCR-DGGE技術在水產品優勢腐敗菌分析方面已經具備了較為成熟的應用實例，這表明PCR-DGGE的應用能夠為建立微生物生長貨架期模型提供理論基礎。但是目前利用PCRTGGE技術來分析水產品優勢菌群的研究還比較欠缺，但是對其他食品的研究還是存在應用實例的，例如顧彩東[49]應用PCR-TGGE技術比較了不同熱處理對牛乳殺菌效果；葉姜瑜等[50]利用PCR-TGGE技術對處理聚甲醛廢水的污水反應器中的微生物群落結構進行了分析，并且取得較理想的試驗結果，這些例子表明利用PCR-TGGE分析技術對水產品中的優勢菌群進行分析也具有較大的應用前景，可以為水產品菌群的分析提供進一步的技術支持。

2.3 PCR-RFLP分析技術

限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技術是在1980年由人類遺傳學家Bostein提出[9]。RFLP是進行基因組研究的基礎，目前主要被廣泛應用于基因定位、生物進化、基因組遺傳圖譜構建等的研究[9]。限制性內切酶的特異性對微生物基因組DNA片段的有效切割產生了阻礙作用。但是將PCR技術與RFLP分析有機地結合在一起則可以得到簡單有效的分子圖譜，該技術稱為PCRRFLP。用于這一目的的特定基因主要為核糖體RNA基因，其中又以16SrDNA PCR-RFLP的方法最為簡便且成熟，因此被廣泛應用。其中對根瘤基因、固氮基因、冷藏豬肉的菌相[51]和江口菌相[52]研究都取得了較好的成效。除此之外，Juvonen等[53]利用特異組PCR-RFLP和實時PCR的方法來檢測和鑒別啤酒中含有厭氧腐敗菌梭狀芽胞桿菌。該試驗主要通過設計16SrRNA基因324-bp可變區的一對特異性引物，并用凝膠電泳和SYBR Green I染料進行實時PCR來評估終點PCR，試驗的目的是為了開發和評估用于檢測和區分啤酒中腐敗菌的群體特異性PCR方法，該試驗結果表明，利用PCR方法測得的試驗結果與培養結果相比很大程度上一致，但是PCR方法更為敏感，該開發的PCR方法可以在單個反應中檢測到9種所有啤酒腐敗菌，并且能夠在組群水平之下進行分化，減少了分析時間，如果把這一方法加以改進后應用于水產品的腐敗菌種鑒別和分析將會提高水產品中腐敗菌分析的效率。潘子強等[54]利用16SrDNA克隆文庫結合RFLP技術探討了導致冷藏真空包裝脆肉鯇魚的SSO。試驗結果表明，冷藏腐敗的真空包裝脆肉鯇魚中含有12種不同分型的細菌類別，該條件下的SSO主要為分型1和2，占克隆子數的58.92%；通過序列比對以及構建的系統發育樹分析顯示，大部分克隆子的序列與氣單胞菌（Aeromonas sp.）的16SrDNA序列有著最大的相似性，這表明真空包裝脆肉鯇魚冷藏的SSO是氣單胞菌（Aeromonas sp.）。這說明利用16SrDNA結合RFLP技術可以簡單快速的確定水產品中的SSO。

2.4 高通量測序技術

高通量測序技術主要包括羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的Solid測序平臺[55]。高通量測序技術具有產出量高、耗費少、測序精確且自動化等優點[24]。454測序技術以焦磷酸測序為原理，它不同于其他高通量測序平臺的顯著特點是讀長較長。目前GS FLX測序系統的序列讀長已不低于400 bp，對于從頭測序等需要長reads的操作，它是較為理想的選擇。Solid是借助于連接反應進行的測序平臺，其基本原理是通過把四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，進而代替傳統的聚合酶連接反應。超高通量是Solid系統最顯著的特征。Solexa Genome Analyzer測序平臺是采用測序、合成同時進行的原理，實現樣本制備的機械化和大規模的平行測序，是一種較低運行成本，較高性價比的高通量測序技術。

高通量測序技術目前己經被廣泛的運用于微生物的研究中。如張芹等[56]利用高通量測序技術研究高糖飲食對小鼠腸道菌群的影響。江艷華等[57]通過高通量測序對貯藏于4、15、25℃的蝦夷扇貝柱菌群結構及優勢腐敗菌進行了分析，試驗結果表明，4℃的SSO為發光桿菌屬（Photobacterium）、別弧菌屬（Aliivibrio）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），分別占46.91%、36.82%、11.01%；15℃的SSO為發光桿菌屬（Photobacterium，46.97%）和別弧菌屬（Aliivibrio，43.33%），25℃的SSO為發光桿菌屬（Photobacterium，41.94%）、別弧菌屬（Aliivibrio，23.10%）、梭桿菌屬（Fusobacterium，10.60%）和乳酸菌屬（Lactobacillus，18.61%）。曹榮等[58]基于高通量測序對冷藏0、4、8 d牡蠣的菌群進行了分析，試驗結果表明，牡蠣冷藏初期的SSO主要以弧菌屬（Vibrio）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas），分別占28.3%，10.3%和7.2%；而在冷藏后期，Vibrio的比例迅速下降，而Shewanella和Pseudoalteromonas在冷藏后期仍然為SSO。這說明利用高通量測序可以對水產品在不同貯藏環境中的優勢菌群進行分析，并且準確性高，在后續研究中可以結合微生物動力學規律用以構建進行貨架期預測的數學模型。

3 結論

水產食品從捕撈上岸到食用這一過程中會由于很多因素影響其貨架期，其中起關鍵作用的主要是微生物的生長和代謝過程中產生的一些化學物質導致水產品發生腐敗變質，但是并非所有的微生物都會對水產食品的腐敗作出貢獻，只有其中的一小部分細菌即SSO才是引起水產品變質的根本原因。因此，水產品在貯藏過程中為了延長貨架期，對其含有的特定腐敗菌進行鑒定并控制是非常有必要的，這表明對水產品中特定腐敗菌的分析技術進行研究、創新也是一個不可或缺的重要過程。

通過對水產品中特定腐敗菌的分析技術進行研究，可以更好地預測并延長水產食品的貨架期，對提高水產品品質具有重要的意義。但是對特定腐敗菌進行研究分析的方法仍存在一些不足之處，例如DGGE方法在應用過程中由于樣品處理方法過于繁瑣，對微生物的檢測靈敏度和測序通量都較低等因素不足以簡便而全面地檢測水產品中的微生物多樣性，除此之外，單一的技術方法在分析水產品特定腐敗菌時存在研究結果不理想、分析不全面的缺點。因此在研究過程中如何選擇省時、省力、性價比高的分析方法是一個值得探討的問題，未來可以考慮將兩種或兩種以上的分析技術相結合或者開發出更為合理、更有應用前景的水產品SSO的分析技術方法。

4 展望

通過水產品SSO隨時間變化的趨勢與描述微生物動力學生長的數學方程如：Logistic方程、Gompertz方程等相結合可以制作水產品剩余貨架期的預測模型，由預測模型編制出相應的軟件，用于提醒消費者該水產品的食用期限，避免浪費，并且提高了通過感官來辨別水產品新鮮度的準確性和有效性。雖然在研究過程中面臨著種種挑戰，但是非常有應用前景。