95%2甲4氯異辛酯原藥小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗研究

王 爽，紀 磊，徐 劍，岑江杰，林師道，方 華，錢浙斌

（浙江省化工研究院有限公司，浙江 杭州 310023）

2甲4氯異辛酯是一種激素型選擇性除草劑，具有較強的內吸傳導性，能和多種除草劑復配，防治水稻田、小麥田多種雜草。2甲4氯異辛酯屬于苯氧乙酸類除草劑，具有用量少、對敏感作物安全性高、對人畜等毒害作用較小的優點，在化學除草領域中得到較廣的應用。在使用時其附著性好，在植物體內易分解成有效成分2甲4氯酸，傳輸速度更快，除草效果優于同類產品2甲4氯鈉、2，4-D丁酯[1]，更重要的是雜草對其產生抗性的速度較為緩慢。目前對于95%2甲4氯異辛酯原藥及其混配制劑的毒理學研究幾乎未見報道。

微核（Micronucleus）是在細胞有絲分裂后期，不能進入子代細胞核中的染色體的斷片或遲滯的染色體，在子代細胞胞漿內形成的一個或幾個次核，其與細胞主核著色一致，呈圓形或橢圓形[2]。它是由染色體、染色單體的無著絲粒斷片或紡錘體損傷后造成滯后染色體在細胞分裂中未包被于主核中形成。在形態上，微核為完全游離于細胞漿中，染色及結構與主核一致，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5。斷裂作用和非整倍體化作用是微核產生的最主要的原因。通常認為前者產生的微核主要由無著絲粒斷片形成，后者產生的微核則由整條染色體形成。但幾乎所有誘發微核的因素都兼有兩種作用。微核形成是細胞受遺傳毒物作用后的一種遺傳學終點，以觀察細胞中微核的形成來檢測遺傳毒物，稱為微核試驗。該試驗快速、簡便，許多國家和國際組織都將其規定為評價農藥 、新藥、食品添加劑等化合物毒理學評價的必做遺傳毒理學試驗之一[3]。

本研究應用體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗檢測95%2甲4氯異辛酯原藥致突變性，為其毒理學安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品

95%2甲4氯異辛酯原藥，褐色透明液體，無刺激性氣味，不溶于水，由國內某作物保護公司提供。

1.2 動物

SFF級ICR小鼠共60只，雌雄各半，體重25～30 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK＜京＞2016-0011。動物飼養于屏障設施內，觀察及適應3天，合格動物用于試驗。試驗動物的飼養環境溫度控制在18℃～25℃。自由采食、飲水。SPF大小鼠生長繁殖飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供。

1.3 試劑與器材

環磷酰胺（CP），批號為 120M1253V，生產廠家為SIGMA；甲醇，批號為2016102401，生產廠家為成都市科龍化工試劑廠；Giemsa染液 （自制），甘油（分析純），小牛血清。手術器械，帶油鏡頭顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），細胞計數器等。

1.4 試驗方法

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗按照《農藥登記毒理學試驗方法》（GB/T 15670-2017）進行操作[2]。本實驗室測得95%2甲4氯異辛酯原藥對雌雄小鼠經口LD50均為1470 mg/kg。本試驗將60只小鼠隨機分成5組，每組12只，雌雄各半。分別為陰性對照組（玉米油，10 mL/kg）、陽性對照組 （環磷酰胺30 mg/kg腹腔注射）、低劑量組（200 mg/kg）、 中劑量組 （400 mg/kg）、 高劑量組（800 mg/kg）。陰性對照組（玉米油）和3個劑量組均按0.1 mL/10 g體重每天1次經口灌胃；陽性對照組按0.1 mL/10 g體重每天1次腹腔注射。各給藥2次，間隔24 h。于第2次給藥后6 h頸椎脫臼處死動物后，取胸骨，擠出骨髓液于載玻片小牛血清里，混勻，涂片自然晾干后放入甲醇中固定15 min，將固定好的涂片放入Giemsa染色約30 min，用蒸餾水沖洗，晾干。每組檢查5只動物，每只動物計數1000個嗜多染紅細胞（PCE），并計數含微核的嗜多染紅細胞數，計算微核率以及嗜多染紅細胞與紅細胞總數的比例。嗜多染紅細胞微核率 （‰）=（含微核的嗜多染紅細胞數/嗜多染紅細胞總數）×1000。

1.5 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件，統計各組微核細胞率的均數和標準差，應用泊松（Poisson）分布對各劑量組與陰性對照組的微核率進行比較。

2 結果

試驗過程中各劑量組動物染毒后2 d內均未出現中毒癥狀。本試驗所用ICR小鼠胸骨骨髓的自發微核千分率（‰）為0.80±0.98，各劑量組小鼠的微核率分別與陰性對照組相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。各劑量組雌雄動物的微核率均小于2‰；而陽性對照組小鼠的微核率顯著地高于陰性對照組（P＜0.01），陽性對照組環磷酰胺誘發的微核率雌雄動物均不低于17‰。見表1。

表1 95%2甲4氯異辛酯原藥小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗結果

3 討論

本試驗ICR雌雄小鼠骨髓微核的自發率均小于3‰，陽性對照環磷酰胺微核率與陰性對照組相差超過10倍，差異顯著，表明試驗可行、可靠。在微核試驗中常用環磷酰胺為誘變劑作陽性對照，給藥劑量和取樣觀察時間對小鼠骨髓微核率的影響較大。根據體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗（GB/T 15670.15-2017），取胸骨或股骨制片均可，環磷酰胺參考劑量和途徑為40 mg/kg（灌胃，ig）或 30 mg/kg（腹腔注射，ip）。有文獻報道用環磷酰胺作為誘導小鼠骨髓細胞微核的陽性對照時，劑量可選擇60～90 mg/kg，取樣時間在給藥后36～48 h，采用一次腹腔注射、胸骨取材可取得較高微核率，結果令人滿意[4]。環磷酰胺經口一次給藥時，其劑量范圍在40～80 mg/kg，采集樣本的時間應在給藥后24～30 h，胸骨髓是微核試驗的最好材料[5]。根據文獻報道并結合實際情況，本試驗取胸骨制片，環磷酰胺劑量和途徑為30 mg/kg（ip），取得了滿意的效果，與文獻報道基本一致。

4 結論

本試驗各劑量組小鼠骨髓細胞微核率未見異常，表明95%2甲4氯異辛酯原藥對小鼠骨髓多染紅細胞無致突變作用。本試驗為致突變的初篩試驗，可為后續的毒理學試驗提供參考，最終是否有遺傳毒性，還需要一系列的試驗組合加以驗證，如細菌回復突變試驗，哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗等。