從雄烯二酮發酵廢液中分離甾醇和油脂的工藝研究

王 瑩 劉鳳霞 薛 剛 婁源民 何際芳

(南陽理工學院生物與化學工程學院1，南陽 473004)(河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室2，南陽 473004)(河南恒天久大實業有限公司3，鄭州 450001)

雄烯二酮在甾體激素類藥物中是不可或缺的重要中間體，現代工業主要采用雙液相體系甾體微生物轉換法生產雄烯二酮[1-2]。微生物轉化甾醇的培養系統需要添加20%的植物油和0.4%的甾醇，經微生物轉化、甲醇提取、脫色、濃縮、結晶、重結晶得合格的雄烯二酮[3-6]。回收甲醇后的乳化液中含有70%～80%油脂和沒被轉化的甾醇，且含有較高濃度油脂和微生物菌體、蛋白質、多糖等物質，最終結合產生高度穩定的乳化液廢棄物，其處理問題成為目前制約企業發展的一個難點[7-11]。

本研究探索一套合理的回收油脂和甾醇工藝，使回收的油脂經過初步精煉后能夠循環使用，或者將回收油脂能夠作為生物柴油的原料，并將回收的甾醇作為雄烯二酮生產的原料，研究雄烯二酮發酵廢液的變廢為寶及資源化綜合利用，以期為其進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用乙酸乙酯、石油醚、甲醇、三氯甲烷、正丁醇等試劑均為分析純；雄烯二酮發酵廢液由河南恒天久大實業有限公司提供。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀；GL-20G-C高速冷凍離心機；RE-52A旋轉蒸發器。

1.3 甾醇與雄烯二酮的檢測

樣品處理:取發酵液中上層樣品1～2 mL，用同樣體積的乙酸乙酯充分溶解，靜置分層，取上層清液稀釋100倍后進樣檢測。

氣相色譜檢測條件:色譜柱mxt 5，柱溫210 ℃，保持3 min，以30 ℃/min的速度升溫到290 ℃保持10 min，進樣口溫度300 ℃，FID 300 ℃，載氣分流比是20∶1，氮氣流速1 mL/min，空氣流速500 mL/min，進樣量5 μL。

1.4 分離甾醇和油脂的工藝步驟

將雄烯二酮發酵廢液進行預熱處理，按一定比例加入萃取溶劑，經過在一定的溫度條件下，進行萃取，經離心后，去沉淀，上清液放入一定溫度條件的冰箱里，冷卻結晶后，離心，沉淀物即為甾醇粗品，上清液進行減壓蒸餾濃縮，回收溶劑，并得到副產品大豆油，在大豆油中加入溶解雄烯二酮效果較好的有機溶劑，同樣進行萃取，離心后冷凍結晶，待結晶養成后，經離心得到雄烯二酮粗品。上清液再次濃縮，回收溶劑和副產品大豆油。分離甾醇和雄烯二酮工藝示意圖如圖1所示。

圖1 分離甾醇和油脂工藝示意圖

1.5 有機溶劑萃取法提取甾醇的工藝參數優化

1.5.1 有機溶劑的選擇

稱取雄烯二酮發酵廢液5 g，分別按體積比為1∶3在試管加入有機溶劑甲醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、乙醇、丙酮、正丁醇各15 mL，并標記名稱，置于50 ℃恒溫水浴鍋中2 h后，觀察其分相情況以及現象，以萃取液上相高度為基準，確定最佳的有機溶劑。

1.5.2 料液比的選擇

稱取五份雄烯二酮發酵廢液5 g，按1∶1、1 ∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3的不同料液比加入最佳有機溶劑，置于恒溫水浴50 ℃條件下2 h后，觀察其分相情況，以萃取液上相溶液的高度為基準，確定最佳的料液比。平行實驗，重復3次。

1.5.3 萃取溫度的選擇

稱取四份雄烯二酮發酵廢液5 g，選擇確定的最佳料液比加入有機溶劑，分別在室溫(19 ℃)、30、40、50 ℃條件下2 h后，觀察其分相情況與現象，以萃取液上相溶液的高度為基準，確定最佳的萃取溫度。平行實驗，重復3次。

1.5.4 萃取時間的選擇

稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，選擇確定的最佳萃取溫度加入有機溶劑，分別在30、60、90、120 min的不同時間條件下，觀察其分相情況與溶液的透明度，以萃取液上相溶液的高度為基準，確定最佳的萃取時間。平行實驗，重復3次。

1.5.5 萃取次數的選擇

分別稱3份取雄烯二酮發酵廢液5 g，分別萃取1、2、3次，在恒溫水浴50 ℃下2 h，吸取上相溶液，在-10 ℃條件下，離心10 min，轉速4 000 r/min，取上清液到試管中，放入0 ℃的冰箱中結晶6 h，然后過濾，稱量沉淀物的濕重。平行實驗，重復3次。

1.5.6 不同濃度有機溶劑對分離甾醇工藝的影響

分別稱取4份雄烯二酮發酵廢液5 g，按優選的最佳條件，分別加濃度為100%、96%、93%、90%的有機溶劑進行萃取，在恒溫水浴50 ℃下萃取2 h，吸取上相溶液在-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，并記錄上相溶液體積。經離心后，取上清液倒入試管中，在0 ℃下結晶6 h，再次離心，稱量沉淀物濕重。平行實驗，重復3次。

1.6 冷卻結晶法分離甾醇的工藝參數優化

1.6.1 結晶溫度的選擇

分別稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，按實驗確定的最佳萃取次數，在恒溫水浴50 ℃下2 h后，經萃取后，取上相于-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，取上清液倒入小試管中，并編號，在10、0、-10 ℃條件下冷卻結晶6 h，觀察其結晶情況與現象。然后過濾，稱量沉淀物的濕重。平行實驗，重復3次。

1.6.2 結晶次數的選擇

分別稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，在實驗確定的最佳條件下，進行實驗后，取萃取上相溶液于-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，取上清液倒入小試管中，并編號，放在確定的最佳條件下，結晶6 h后，經過濾，沉淀物稱量其濕重，而濾液再次倒入試管，放入冰箱繼續結晶6 h，然后過濾，并再次稱量其濕重，取濾液再次結晶6 h。再次過濾，稱量沉淀物濕重。觀察3次結晶的情況與現象。平行實驗，重復3次。

1.7 溶劑回收及雄烯二酮的分離

將分離甾醇后的上清液進行減壓蒸餾回收溶劑。并得到一定濃度的濃縮物，然后向濃縮物中添加溶劑甲醇進行萃取，濃縮甲醇相到一半，冷凍結晶，冷凍離心沉淀物即雄烯二酮及其他副產品。再將上清液進行濃縮回收有機溶劑以及其他副產品。

2 結果和分析

2.1 有機溶劑萃取法提取甾醇的工藝參數優化

2.1.1 有機溶劑的選擇比較

稱取質量5 g的雄烯二酮發酵廢液，按料液比1∶3分別加入丙酮、甲醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇等有機溶劑15 mL，充分搖勻，在恒溫水浴50 ℃下萃取2 h后，觀察溶劑的萃取情況。結果顯示：甲醇、乙醇、丙酮雖然能夠快速分出沉淀，但得到的甾醇和油較少。石油醚和三氯甲烷則無法高效地實現破乳效果，影響后續工藝操作；只有乙酸乙酯作為萃取劑時，不會形成乳化液，因此破乳劑優選為乙酸乙酯。乙酸乙酯與乙醇最好，其余溶劑的效果不佳。乙酸乙酯作為中等極性溶劑，在萃取油水兩相中不會形成乳化液，且較容易過濾。而其他非極性溶劑在分離時會形成乳化液，對甾醇的分離造成很大的影響，使得分離甾醇較難。因此，本實驗初步選擇的最佳溶劑為乙酸乙酯。

2.1.2 料液比對分離工藝的影響

稱取5份雄烯二酮發酵廢液5 g，按1∶1、1 ∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3的不同料液比加入溶劑乙酸乙酯，置于恒溫水浴50 ℃條件下2 h后，觀察其分相情況以及萃取液的顏色透明度變化，以萃取液上相溶液的高度為基準，有機溶劑不同料液比的沉降高度比較見圖2。

為判斷不同料液比對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的料液比，對上述單因素進行方差分析，不同料液比對萃取量的影響方差分析見表1。

結果顯示：料液比對萃取分離甾醇的結果達到極顯著水平，為了確定不同料液比與分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同料液比對乙酸乙酯高度的顯著性比較見表2。

圖2 有機溶劑不同料液比、不同萃取時間及溫度的乙酸乙酯相沉降高度比較

料液比平均數差異顯著性α=0.05α=0.01萃取次數平均數差異顯著性α=0.05α=0.011∶39.167aA2次1.267aA1∶2.57.567bB3次0.778bB1∶26.733cC1次0.633cC1∶1.54.033dD1∶13.433eE

由結果分析：在料液比在1∶1到1∶3之間，乙酸乙酯的萃取率在隨料液比的增加不斷增大，五組不同料液比均達到極顯著水平。因此選取料液比為1∶3最佳。

2.1.3 萃取溫度對分離工藝的影響

稱取4份雄烯二酮發酵廢液5 g，按料液比為1 ∶3加入15 mL的乙酸乙酯溶劑，分別在室溫(19 ℃)、30、40、50 ℃條件下2 h后，觀察其分相情況與現象，以萃取液上相溶液的高度為基準，不同萃取溫度的分析比較見圖2。為判斷不同萃取溫度對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的溫度，對上述單因素進行方差分析，不同萃取溫度對分離工藝的影響方差分析見表3。

結果顯示，萃取溫度對萃取分離甾醇的結果達到極顯著水平，為了確定不同溫度與分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著比較。不同萃取溫度對萃取量的顯著性比較見表4。

表1 不同料液比及萃取次數對萃取量的影響方差分析

注：*表示顯著水平，**表示極顯著水平。

表3 不同萃取溫度、萃取時間及乙酸乙酯濃度對分離工藝的影響方差分析

注：*表示顯著水平，**表示極顯著水平。

表4 不同萃取溫度、萃取次數、乙酸乙酯濃度對萃取量的顯著性比較

結果顯示在溫度19～50 ℃之間，乙酸乙酯的萃取率隨溫度的增加而增大，四組數據均達到極顯著水平。因此，選取萃取溫度為50 ℃為最佳。

2.1.4 萃取時間對分離工藝的影響

稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，按1∶3的料液比加入乙酸乙酯，分別在30、60、90、120 min的不同時間條件下，觀察其分相情況與溶液的透明度，以萃取液上相溶液的高度為基準。不同萃取時間的分析比較見圖1。

為判斷不同萃取時間對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的萃取時間，對上述單因素進行方差分析，不同萃取時間對分離工藝的影響方差分析見表3。結果顯示，不同萃取時間對萃取分離甾醇的結果未達到極顯著水平，為了確定不同萃取時間與分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同萃取時間對工藝影響的顯著性比較見表4。結果表明萃取時間在30～120 min范圍內，30 min與120 min有顯著性差異，60 min與90 min差異不顯著，考慮對分離提取率的效果，選擇萃取時間為120 min為佳。

2.1.5 萃取次數對分離工藝的影響

稱取雄烯二酮發酵廢液5 g，按料液比1∶3加入乙酸乙酯15 mL，分別按1、2、3次進行萃取，在恒溫水浴50 ℃放置2 h后，上相離心后置于0 ℃條件下結晶6 h，離心稱量沉淀物濕重，不同萃取次數的比較見表5。

表5 不同萃取次數的比較

為判斷不同萃取次數對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的萃取次數，對上述單因素進行方差分析，不同萃取次數對分離工藝的影響方差分析見表1。結果顯示，不同萃取次數對萃取分離甾醇的結果達到極顯著水平，為了確定不同萃取次數與分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同萃取次數對工藝影響的顯著性比較見表2。

結果分析：在萃取次數分別為1、2、3次萃取范圍內，對甾醇的分離均達到極顯著差異，根據分離的效果比較，選擇萃取次數為兩次最佳。

2.1.6 不同濃度乙酸乙酯對分離效果的影響比較

分別稱取四份雄烯二酮發酵廢液5 g，按料液比1∶3分別加濃度為100%、96%、93%、90%的有機溶劑進行萃取，在恒溫水浴50 ℃下萃取2 h，吸取上相溶液在-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，并記錄上相溶液體積。經離心后，取上清液倒入試管中，在0 ℃下結晶6 h，再次離心，稱量沉淀物濕重，乙酸乙酯的濃度對分離效果的比較見表6。

表6 乙酸乙酯的濃度對分離效果的比較

為判斷不同乙酸乙酯濃度對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的乙酸乙酯濃度，對上述單因素進行方差分析，不同純度乙酸乙酯對工藝的方差分析見表3。結果顯示，不同乙酸乙酯濃度對萃取分離甾醇的結果達到顯著水平，為了確定不同乙酸乙酯濃度對分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同濃度乙酸乙酯對工藝影響的顯著性比較見表4。

結果分析：在乙酸乙酯不同濃度的范圍中，純度為100%、90%達到顯著性差異，96%、93%未達到顯著性差異，根據乙酸乙酯分離甾醇效果的比較，考慮溶劑的循環有效利用，選擇乙酸乙酯濃度為90%為最佳條件。

2.2 冷卻結晶法分離甾醇的工藝參數優化

2.2.1 不同結晶溫度對工藝影響的單因素實驗

分別稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，萃取兩次，在恒溫水浴50 ℃下2 h后，經萃取后，取上相于-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，取上清液倒入小試管中，并編號，在10、0、-10 ℃條件下冷卻結晶6 h，觀察其結晶情況與現象。然后過濾，稱量沉淀物的濕重。不同結晶溫度的分析比較見表7。

表7 不同結晶溫度的分析比較

為判斷不同結晶溫度對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的結晶溫度，對上述單因素進行方差分析，不同結晶溫度的對分離工藝影響的方差分析見表8。

表8 不同結晶溫度的對分離工藝影響的方差分析

注：*表示顯著水平，**表示極顯著水平。

結果顯示，不同結晶溫度對萃取分離甾醇的結果達到顯著水平，為了確定不同結晶溫度與分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同結晶溫度對工藝影響的顯著性比較見表9。

表9 不同結晶溫度對工藝影響的顯著性比較

結果分析:在0、10、-10 ℃之間，只有0 ℃與-10 ℃達到顯著性差異，10 ℃未能達到顯著性差異，根據對分離甾醇提取率的影響，選擇0 ℃為最佳結晶溫度。

2.2.2 不同結晶次數及結晶溫度對工藝影響的兩因素實驗

分別稱取3份雄烯二酮發酵廢液5 g，按1∶3的料液比加入乙酸乙酯，在恒溫50 ℃水浴中萃取2 h，并萃取兩次，取萃取上相溶液于-10 ℃離心10 min，轉速4 000 r/min，取上清液倒入小試管中，并編號，在0 ℃條件下，結晶6 h后，經過濾，沉淀物稱量其濕重，而濾液再次倒入試管，放入冰箱結晶6 h，然后過濾，并再次稱量其濕重，取濾液再次結晶6 h。再次過濾，稱量沉淀物濕重。不同結晶次數及結晶溫度的分析比較見表10。

表10 不同結晶次數及結晶溫度的分析比較

為判斷不同結晶次對分離甾醇工藝的影響是否顯著，以確定最佳的結晶次數，對上述單因素進行方差分析，不同結晶次數對分離工藝影響的方差分析見表11。

表11 不同結晶次數及結晶溫度對分離工藝影響的方差分析

注：*表示顯著水平，**表示極顯著水平。

結果顯示，不同結晶次數對萃取分離甾醇的結果均達到極顯著水平，為了確定不同結晶溫度和結晶次數對分離效果的影響差異，采用LSD(最少顯著數法)進行顯著性比較。不同結晶次數對工藝影響的顯著性比較見表12。

表12 不同結晶次數對工藝影響的顯著性比較

結果表明在不同的結晶次數下，1、2次均達到顯著性差異，3次未能達到顯著性差異，根據結晶次數對分離甾醇提取率的影響，選擇最佳結晶次數為2次。

2.3 驗證實驗

按照上述工藝進行驗證實驗，以乙酸乙酯為溶劑，按料液比(1∶3)萃取溫度50 ℃、萃取兩次、結晶溫度為0 ℃、結晶時間為6 h、結晶二次得到甾醇提取率為46%，純度達到80%以上；按料液比1∶3加入甲醇溶解濃縮物，濃縮到體積的一半后，冷卻結晶18h，離心，沉淀物得到含雄烯二酮粗品的產品，提取率為66.61%。上清液再次濃縮，回收溶劑和副產品大豆油。

3 結論

3.1 有機溶劑異丙醇、正己烷、石油醚對甾醇和雄烯二酮均有良好的溶解性，但在一定溫度條件下分相效果上不佳，原因是發酵液中會形成乳化劑，使得分相難。實驗選擇采用中等極性的乙酸乙酯溶劑，在不需加任何助濾劑的情況下就可以自然沉降，從而解決工業上需要離心需消耗大量試劑的問題。

3.2 甾醇和雄烯二酮在大豆油中均具有良好的溶解，在發酵液中加入20%的大豆油時，甾醇的轉化率達到到85%以上，在經過乙酸乙酯萃取后，分離甾醇后，可以濃縮回收溶劑以及大豆油，使得大豆都可以同時重復使用，與其他研究學者所研究的兩相系統比較[2]，工藝更加簡便，在工業上更具有可行性，而且分離效果也較好。

3.3 通過單因素實驗考察乙酸乙酯的倍數、萃取溫度、萃取時間、萃取次數對分離甾醇的影響，確定最佳工藝條件為：萃取料液比1∶3，萃取溫度50 ℃，萃取次數為二次，萃取時間為2 h。與文獻報道酶法甲酯化提取甾醇相比較[12]，該工藝操作更加簡單可行。