pH,Na+和Ca2+對(duì)大豆種皮果膠類多糖乳化穩(wěn)定性的影響

趙玲玲 張紅運(yùn) 范宏亮 楊艷萍 王勝男 楊立娜 李 君 何余堂 朱丹實(shí) 劉 賀

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，錦州 121013)(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2,長春 130000)

大豆種皮是大豆深加工中最大的副產(chǎn)物，占整個(gè)大豆總質(zhì)量的8%，具有價(jià)格低廉、貯存容易、果膠含量較高等特點(diǎn)[1]。與工業(yè)化生產(chǎn)的大豆水溶性多糖相比，大豆種皮果膠類多糖具有優(yōu)良的凝膠、乳化、增稠等特性[2]。

大豆種皮果膠類多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、多聚半乳糖醛酸等組成[3]，果膠類多糖結(jié)構(gòu)中含有疏水基團(tuán)，可與蛋白質(zhì)在油-水界面結(jié)合形成空間位阻，具有較好的乳化穩(wěn)定性[4]。在乳化過程中，疏水性的多糖在油-水界面具有強(qiáng)烈的吸附能力或直接與蛋白質(zhì)絡(luò)合[5]，同時(shí)通過增加乳液的黏性以防止乳液液滴重力分離從而形成穩(wěn)定乳液[6]。趙麗[7]采用不同方法提取大豆皮多糖并分析多糖性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微波輔助草酸銨提取大豆皮多糖制成乳液黏度大，粒度分布均勻，穩(wěn)定性好。但乳液穩(wěn)定性不僅與多糖本身(酯化度、分子量等)及濃度有關(guān)，還受pH、離子強(qiáng)度等外源性因素影響[8]。調(diào)節(jié)pH及添加金屬離子可中和多糖自身電荷或改變其分子形態(tài)。Akihiro等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同pH值提取可溶性大豆多糖的乳化性能差異顯著。Makoto 等[10]通過對(duì)比甜菜果膠(SBP)，大豆可溶性多糖(SSPS)和樹膠(GA)的乳化性能，發(fā)現(xiàn)SSPS在較高pH及鹽濃度范圍下，乳液穩(wěn)定性降低。目前關(guān)于大豆種皮果膠類多糖乳化穩(wěn)定性研究較少，更缺乏關(guān)于pH,Na+和Ca2+對(duì)SHPP穩(wěn)定乳液能力影響的信息，所以本研究探索pH和鹽濃度對(duì)用SHPP制備乳液穩(wěn)定性的影響，從而進(jìn)一步推動(dòng)SHPP在食品工業(yè)中的應(yīng)用及飲料產(chǎn)品開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮；大豆色拉油；草酸銨、乙醇、HCl、NaOH：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)；Discovery DHR-1 TA流變儀；尼康80I光學(xué)顯微鏡；HYL-108激光粒度儀；RE3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱；SL-250A高速多功能粉碎機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 SHPP制作工藝流程

將大豆種皮除雜，粉碎后過60目篩。稱取大豆種皮100 g，按料液比1∶20加入1%的乙醇溶液，室溫?cái)嚢?0 min，過濾，放置65 ℃恒溫干燥箱中烘干。稱取烘干后的大豆皮殘?jiān)戳弦罕?∶20加入0.6%的草酸銨，在微波功率320 W作用20 min，取上清液。將上清液4 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的液體濃縮至原體積的1/3，調(diào)節(jié)pH至4。加入無水乙醇使乙醇含量達(dá)到70%，于4 ℃下放置2 h后，在25 ℃，4 000 r/min條件下離心30 min。將獲得的沉淀于65 ℃恒溫干燥箱中烘干[11]。

1.3.2 乳液的制備

配制100 mL乳液，首先用大豆分離蛋白溶液與大豆油混合，利用高速剪切機(jī)在10 000 r/min下剪切2 min，制成初級(jí)溶液。配制SHPP水溶液，繼續(xù)利用高速剪切機(jī)在10 000 r/min下剪切2 min，與初級(jí)溶液完全混合，最終使乳液包含20%油，3%大豆分離蛋白和2% SHPP，向最終乳液中添加0.02%疊氮化鈉來抑制微生物生長，制成的乳液4 ℃下儲(chǔ)存，備用[12]。

1.3.3 環(huán)境因素對(duì)SHPP乳化性質(zhì)的影響

1.3.3.1 pH對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

調(diào)節(jié)乳液的pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，以未對(duì)溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的溶液作為空白對(duì)照并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行分析，探討pH值對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。

1.3.3.2 陽離子存在對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

Dario等[13]研究大豆皮可溶性多糖(HSPS)的乳化性能時(shí)，發(fā)現(xiàn)乳液含有0.2 mol/L Na+和0.05 mol/L Ca2+時(shí)液滴粒徑最小，乳化穩(wěn)定性最好。本實(shí)驗(yàn)借鑒Dario M.Cabezas的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將0.2 mol/L的氯化鈉溶液和0.05 mol/L的氯化鈣溶液與SHPP水溶液混合，制成乳液后對(duì)其進(jìn)行分析，重點(diǎn)討論0.2 mol/L Na+、0.05 mol/L Ca2+存在對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 總糖及蛋白質(zhì)含量測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[14]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，在490 nm波長處測定。蛋白含量根據(jù) GB/T 50095-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品中蛋白質(zhì)的測定。

1.3.5 粒徑分布的測定

采用激光粒度分布儀測定乳液粒徑[15]，取200 μL乳液加入激光粒度分布儀進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)定為：激光波長633 nm，散射角度90°，溫度25 ℃，顆粒吸收率0.001，顆粒折射率1.52；遮光率范圍為5～20，折射率1.333。

1.3.6 流變分析

穩(wěn)態(tài)流變分析：采用DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀測定，取1 mL乳液加在測試臺(tái)上，于25 ℃條件下采用40 mm平行板夾具，狹縫距離設(shè)置為0.5 mm，剪切速率0～200 s-1，檢測樣品流變特性[16]。

振蕩流變分析：將1.5 mL乳液加在測試臺(tái)上后，進(jìn)行動(dòng)態(tài)頻率掃描，掃描頻率范圍設(shè)定為0.01～3 Hz，檢測整個(gè)過程的模量變化。40 mm平行板夾具，狹縫距離為0.5 mm，應(yīng)力為1.0 Pa，所有的測量均在25 ℃下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中加蓋密封圈以避免水分過度蒸發(fā)[17]。

1.3.7 光學(xué)顯微觀察

將乳液稀釋10倍后，滴于載玻片上，待液滴均勻鋪展，為避免氣泡產(chǎn)生，將蓋玻片輕輕覆蓋于乳液液滴表面，置于(10倍、100倍)光學(xué)顯微鏡下觀察液滴的形態(tài)[18]。

1.3.8 脂肪上浮率

脂肪上浮率的測試參照 Karimi 等[19]的方法，略有改動(dòng)。吸取 10 mL 剛制備的乳液樣品于玻璃管中(直徑1.5 cm，高度12 cm)，并用塑料蓋密封，防止乳液揮發(fā)。同時(shí)記錄不同條件下乳液的清液層高度(Hs，下層)和總高度(Ht)。

脂肪上浮率(CI)定義為：CI=(Hs/Ht)×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。用origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖及蛋白質(zhì)含量

測定SHPP總糖含量約為52.09%，蛋白含量約為6.93%。

2.2 pH對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

2.2.1 pH對(duì)乳液粒徑的影響

如表1所示，pH值對(duì)乳液的粒徑有顯著影響(P<0.05)。隨著pH值升高，乳液D3,2和D4,3逐漸減小，當(dāng)pH值達(dá)到4.0時(shí)最小。當(dāng)pH>4.0，乳液的D3,2和D4,3逐漸升高。當(dāng)pH<4.0，乳液pHpI，蛋白質(zhì)自身帶靜電或負(fù)電，與陰離子多糖形成較弱的可逆復(fù)合物，兩者間從靜吸引到靜排斥[21]，油滴表面吸附層結(jié)構(gòu)不致密，顆粒粒徑增大，乳液穩(wěn)定性減弱。

表1 不同pH對(duì)乳液平均粒徑的影響

注：每列標(biāo)注不同小寫字母表示存在顯著差異P<0.05。

2.2.2 pH對(duì)乳液流動(dòng)特性的影響

圖1 不同pH對(duì)乳液黏度和剪切應(yīng)力的影響

液滴粒徑大小、連續(xù)相的黏度及組成成分等都可影響乳液流變學(xué)性質(zhì)[22]。如圖1所示，乳液的表觀黏度均隨著剪切速率增大而顯著降低，即出現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象。當(dāng)乳液pH值為4.0時(shí)，乳液黏度及剪切應(yīng)力值最高。圖2中的儲(chǔ)能模量及損耗模量分別反映材料的彈性及黏性大小，其中pH值為6.0，7.0時(shí)彈性及黏性較差。反之，pH值為4.0時(shí)彈性及黏性最好有利于乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。在pH值為4.0時(shí)，由于大豆蛋白的等電點(diǎn)在4.5左右[23]，SHPP可吸附在蛋白表面形成厚厚的界面膜，致使過剩帶相反電荷的SHPP游離在水相中，且水中游離大量H+，導(dǎo)致-COO-數(shù)目減少，SHPP彼此間排斥力減小而團(tuán)聚，乳液的黏度增大[24]。隨著pH逐漸增大，乳液中OH-增加，一方面OH-與SHPP相互吸引，使多糖分子形態(tài)發(fā)生改變，另一方面多糖分子自身水解，與H+結(jié)合，導(dǎo)致乳液黏度減小，穩(wěn)定性降低[25]。

圖2 不同pH對(duì)乳液儲(chǔ)能模量和損耗模量的影響

2.2.3 pH對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

從圖2可直觀看出，當(dāng)pH值為3.0、4.0時(shí)乳化顆粒均呈較為規(guī)則的圓形，此時(shí)，乳液穩(wěn)定性較好，pH值為5.0時(shí)乳化顆粒呈大小不均一的圓形，pH值為6.0、7.0時(shí)乳化顆粒呈現(xiàn)較不規(guī)則的橢圓形，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，如圖2所示，此時(shí)乳液的黏彈性最好，在均質(zhì)過程中，由于增加連續(xù)相的黏度，同時(shí)增加剪切應(yīng)力，可以讓液滴碰撞頻率降低，乳液粒徑減小且不易聚集，形成較規(guī)則的圓形[26]，在pH高于5.0時(shí)，SHPP與界面上的蛋白不發(fā)生靜電吸附而彼此排斥，SHPP離開界面而游離在水相中，SHPP無法為蛋白提供足夠的靜電及空間位阻屏障，所以蛋白可發(fā)生部分疏水聚集，從而導(dǎo)致液滴間相互聚集，乳化顆粒變大，影響乳液的乳化穩(wěn)定性[27]。Li[28]利用殼聚糖包埋β-乳球蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)均能夠維持良好的乳化穩(wěn)定性，而pH高于6.0時(shí)相對(duì)不穩(wěn)定，與本研究結(jié)果相似。

注：a-e分別表示pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時(shí)油鏡100倍下觀察得到的微觀圖，照片標(biāo)尺為10 μm；A-E分別表示同等操作物鏡10倍下得到的微觀圖，照片標(biāo)尺為100 μm。圖3 不同pH對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.2.4 pH對(duì)乳液分層穩(wěn)定性的影響

從圖4可知，乳液 pH值為4.0時(shí)脂肪上浮率最小。在pH值3.0～4.0范圍內(nèi)，隨著溶液pH值升高，乳液的分油率隨之降低，pH<4.0時(shí)，低于多糖的側(cè)鏈基團(tuán)的解離常數(shù)pKa，—COO-基團(tuán)部分質(zhì)子化，導(dǎo)致液滴間靜電斥力減小，油滴發(fā)生團(tuán)聚，上浮[29]。隨著 pH 升高接近蛋白等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子本身聚集的趨勢增加，但由于SHPP可與蛋白產(chǎn)生空間排阻及SHPP彼此間會(huì)產(chǎn)生靜電排斥，抑制油滴聚集[30]。在pH值4.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值升高，乳液的脂肪上浮率逐漸增大，乳液的穩(wěn)定性逐漸下降，pH值達(dá)到6.0時(shí)趨于平緩。

2.3 陽離子存在對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響

2.3.1 陽離子存在對(duì)乳液粒徑的影響

從表2可知，與未加陽離子的乳液相比，不同陽離子對(duì)乳液粒徑有顯著影響(P<0.05)。向乳液中添加0.2 mol/L Na+，乳液D4,3和D50分別為74.52 μm和47.62 μm，大于未加陽離子的乳液，說明添加高濃度的Na+可促進(jìn)液滴的絮凝和聚集，可能是高濃度陽離子游離在水相，帶相反電荷的離子在SHPP和蛋白表面積累，通過屏蔽蛋白和SHPP自身帶電量，降低了彼此間的靜電吸引力，同時(shí)，大量的鹽離子加入到體系中蛋白會(huì)發(fā)生鹽析而沉淀[31]，導(dǎo)致粒子變大。乳液中添加0.05 mol/L Ca2+，乳液的平均粒徑略大，Ca2+的存在，一方面可降低蛋白的溶解度，另一方面可與SHPP分子局部交聯(lián)，增加了SHPP分子的剛性，液滴之間更容易發(fā)生沉淀聚集。但是，由于添加Ca2+的濃度過低，可能只是屏蔽蛋白與SHPP的部分帶電量，蛋白與多糖之間會(huì)繼續(xù)發(fā)生靜電吸附作用，同時(shí)液滴之間也會(huì)產(chǎn)生靜電排斥，阻礙顆粒的進(jìn)一步聚集，所以液滴粒徑略有增大。

表2 陽離子對(duì)乳液平均粒徑的影響

注：(1)每列標(biāo)注不同小寫字母表示存在顯著差異P<0.05。(2)空白樣為未添加陽離子的樣品。

2.3.2 陽離子存在對(duì)乳液流變特性的影響

由圖5可知，空白及含陽離子的乳液表觀黏度均隨著剪切速率增加而降低，表現(xiàn)出剪切變稀的流體特性，未添加陽離子時(shí)，乳液的黏度及剪切應(yīng)力高于含Na+和Ca2+的乳液，含Ca2+的乳液起始黏度最低為0.56 Pa·s。圖6反映出不含陽離子的乳液彈性及黏性相對(duì)較大。其原因可能在于Na+和Ca2+對(duì)SHPP的黏度行為具有很大影響，多糖的特性黏度受多糖分子間的靜電相互作用而降低，Na+、Ca2+作為反離子與SHPP分子中的羧基相互作用，改變了多糖分子的構(gòu)象，受到鹽橋作用，使分子鏈由舒展到緊縮[32]。因此Na+和Ca2+存在會(huì)降低SHPP的黏度，從而降低其乳化穩(wěn)定性。

圖4 不同pH對(duì)乳液分層穩(wěn)定性的影響

圖5 陽離子存在對(duì)乳液黏度和剪切應(yīng)力的影響

圖6 陽離子存在對(duì)乳液儲(chǔ)能模量和損耗模量的影響

2.3.3 陽離子存在對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可知，未添加陽離子乳液的乳化顆粒均呈較為規(guī)則的圓形，而添加Na+和Ca2+乳液的乳化顆粒呈現(xiàn)較不規(guī)則的橢圓形，乳化顆粒大小：B>C>A，與表2結(jié)果一致。因?yàn)镹a+和Ca2+帶正電荷，而SHPP自身帶負(fù)電荷，隨著乳液中帶相反電荷的離子增加，屏蔽多糖自身的帶電量，從而減小分子與分子間的靜電斥力，液滴間發(fā)生聚合，同時(shí)，鹽的相互作用會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生絮凝，有效的降低蛋白質(zhì)的溶解度，由于形成一個(gè)三維的聚合液滴網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而阻礙乳化過程[33]，因此，陽離子存在可降低乳液乳化穩(wěn)定性。

注：a-c分別表示乳液中未添加陽離子、添加Na+、Ca2+時(shí)油鏡100倍下觀察得到的微觀圖，照片標(biāo)尺為10 μm；A-C分別表示同等操作物鏡10倍下得到的微觀圖，照片標(biāo)尺為100 μm。圖7 陽離子存在對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.3.4 陽離子存在對(duì)乳液分層穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，未添加陽離子時(shí)，乳液的脂肪上浮率最低為37%，向其中添加Na+，脂肪上浮率最高為56%，此時(shí)由于大量鹽離子存在，使水的活度降低，蛋白表面的疏水殘基充分暴露，蛋白與蛋白發(fā)生聚而沉淀[34]，同時(shí)油滴界面電荷減少，油滴與油滴聚集，由于重力作用，油脂上浮析出。向其中添加Ca2+時(shí)脂肪上浮率為38%，說明0.05 mol/L Ca2+的存在對(duì)乳液乳化穩(wěn)定性影響不顯著，可能由于Ca2+是高價(jià)離子，屏蔽蛋白和SHPP的部分電荷，使蛋白與多糖之間靜電斥力減弱，但粒子與粒子間仍然存在靜電互斥作用，所以有效緩解了油滴的上浮。

圖8 陽離子存在對(duì)乳液分層穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

大豆種皮果膠類多糖具有良好的乳化性質(zhì)，其乳化穩(wěn)定性隨pH值和陽離子存在的變化差異顯著。pH 4.0時(shí)，乳化顆粒粒徑最小，黏度及剪切應(yīng)力最大，脂肪上浮率最低，乳化性最佳。添加0.2 mol/L Na+可促使乳液乳化穩(wěn)定性降低，而添加0.05 mol/L Ca2+對(duì)降低乳液乳化穩(wěn)定性作用較小。本研究結(jié)果表明，SHPP在酸性介質(zhì)中可吸附在油-水界面形成黏彈性膜，因此可用作酸性O(shè)/W乳液中有效的乳化劑，同時(shí)，應(yīng)避免添加金屬離子屏蔽SHPP自身帶電量。