微波預處理對小麥面筋蛋白糖基化改性的影響

楊雪飛 臧艷妮 趙妍嫣 羅水忠 姜紹通 鄭 志

(合肥工業大學食品科學與工程學院；安徽省農產品精深加工重點實驗室，合肥 230009)

小麥面筋蛋白，又稱谷朊粉，其氨基酸組成齊全、來源廣泛，是一種營養豐富且經濟的植物蛋白[1]。小麥面筋蛋白具有良好的黏彈性、可降解性及成膜性[2,3]，被廣泛應用于焙烤食品及生物可降解材料領域[4,5]。然而小麥面筋蛋白含有大量的疏水性氨基酸，導致其溶解性較差，進而影響其功能性質，限制了其應用范圍[6,7]。

蛋白質的糖基化是依據美拉德反應的基本原理，由蛋白質分子側鏈上的自由氨基與糖分子還原末端的羰基之間發生的羰氨反應[8]。該反應是由蛋白質和還原糖經加熱自發進行的，不需要加入任何其他化學試劑，是一種相對理想的化學改性方式，能夠有效的改善蛋白質的溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、熱穩定性等功能性質[9-11]。基于小麥面筋蛋白是一種結構緊湊的球蛋白，一些反應基團可能被包裹在分子內部，使得蛋白分子與糖分子不能充分接觸，不利于糖基化反應的進行[12]。通過對小麥面筋蛋白進行適當的預處理，可以使其結構變得松散，反應基團暴露，促進糖基化反應的發生。

微波處理可以產生高頻電磁場，使反應體系中的極性分子隨著頻率的改變而來回振動，產生熱能[13]。微波加熱時，能夠斷裂蛋白質中的二硫鍵，使蛋白中的游離巰基含量增加，且在微波加熱的過程中，蛋白質的疏水基團暴露，提高蛋白質的溶解性[14]。張海華等[15]對微波處理后小麥面筋蛋白結構的變化進行了研究，發現微波能夠減弱小麥面筋蛋白分子間/分子內的非共價作用，斷裂二硫鍵，破壞小麥面筋蛋白的結構，使其變得松散。謝歡[16]探究了微波對蛋清蛋白糖基化反應的影響，結果表明隨著微波功率和時間的增加，美拉德反應程度逐漸增高。本實驗采用微波預處理小麥面筋蛋白，再進行糖基化改性，研究改性前后小麥面筋蛋白溶解性和乳化性的變化，探究微波處理對小麥面筋蛋白糖基化效率的影響機制，為拓寬其應用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白、葡萄糖、大豆油、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、十二烷基磺酸鈉、ANS 、考馬斯亮藍G250、牛血清蛋白其他化學試劑為分析純。其中小麥面筋蛋白的組成如表1所示：

MM823LA6-NS微波爐；PHS-3C雷磁pH計； FD-1B-50冷凍干燥機；UDK152全自動凱氏定氮儀； UV757CRT紫外可見分光光度計；Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀；Bio-Rad電泳儀。

表1 小麥面筋蛋白的基本組成

1.2 改性小麥面筋蛋白樣品的制備

配制5%的小麥面筋蛋白溶液，磁力攪拌1 h使其分散均勻，將小麥面筋蛋白溶液置于頻率為3.0 GHz的微波爐中采用不同功率處理(70、210、350、560、700 W)，處理時間為60 s，將所得小麥面筋蛋白樣品分別標記為WG-0、WG-70、WG-210、WG-350、WG-560、WG-700。處理結束后，一部分樣品進行冷凍干燥、備用；另一部分用1 mol/L的NaOH調節pH至12.0，再加入等質量的葡萄糖，磁力攪拌1 h，使兩者充分混勻，用1 mol/L的HCl調節pH至10.0，密封后放入80 ℃水浴搖床中反應1 h，反應結束后迅速冰浴冷卻至室溫，離心(8 000 r/min，20 min)，取上清液置于透析袋中透析24 h，冷凍干燥，即得到復合改性的小麥面筋蛋白，分別記為WG-G0、WG-G70、WG-G210、WG-G350、WG-G560、WG-G700。

1.3 測定方法

1.3.1 接枝度測定

參照Lertittikula等[17]的方法進行接枝度測定，取125 μL糖基化樣品蛋白溶液與2 mL 0.21 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.2)混合，再加入1 mL 0.01%的TNBS溶液，振蕩混勻，在50 ℃水浴中避光反應1 h，之后加入2 mL 0.1 mol/L Na2SO3溶液，室溫冷卻30 min，于420 nm處測定吸光值At。以相同條件下加入125 μL未經水浴加熱的小麥面筋蛋白溶液作為空白對照，在420 nm下測定其吸光度值A0，按下式計算接枝度。

式中:A0表示未反應樣品吸光度；At表示反應t時間后樣品吸光度。

1.3.2 褐變程度及中間產物測定

參考文獻[18]的方法稍作修改。糖基化反應的中間產物在294 nm處有吸光值，褐變程度可以用420nm處的吸光值進行測定。取2.0 mL樣液用蒸餾水稀釋一定的倍數，以蒸餾水作空白對照，分別測定294 nm和420 nm處的吸光值。

1.3.3 溶解性測定

將微波處理的和復合改性的小麥面筋蛋白分別用蒸餾水配制成1%的樣品溶液，室溫下攪拌，使其分散均勻。然后用1 mol/L的NaOH/HCl溶液將pH分別調節為4～10，震蕩混勻，離心(8 000r/min，20 min)，采用考馬斯亮藍法[19]測定上清液中的蛋白含量。利用牛血清蛋白作標準曲線，根據上清液中蛋白含量與溶液中總蛋白含量比值計算糖基化產物的溶解性。

1.3.4 乳化性測定

參照文獻[20]的方法測定乳化性。分別取24 mL 2 mg/mL 微波處理的樣品溶液和復合改性的樣品溶液(樣品蛋白溶于0.2 mol/L，pH 8.2磷酸鹽緩沖液中)，邊攪拌邊緩慢加入8 mL大豆油，高速均質(10 000 r/min，25 ℃，1 min)。而后分別在0 min和10 min時從所制乳狀液的底部取樣液50 μL，加到5 mL質量分數為0.1% SDS溶液中，測定其在500 nm處的吸光值(A0，A10)，以相同質量分數的SDS溶液作空白。乳化活性指數(EAI，m2/g)和乳化穩定性指數(ESI，min)的計算公式如下：

式中：DF為稀釋倍數，DF=100；C為樣品濃度，g/mL；φ為光程，φ=1 cm；θ為乳液中油相所占比例，θ=0.25；A0為0 min時測定的吸光度；A10為10 min時測定的吸光度。

1.3.5 表面疏水性測定

參照Wang等[21]的方法。取100 mg微波處理樣品及微波-糖基化復合處理樣品分別分散于15 mL pH 7.0的0.01 mol/L 磷酸緩沖液中，于7 000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白濃度。將上清液稀釋至不同的濃度梯度(分別稀釋1、0.75、0.50、0.25和0.125倍)，再取40 μL ANS試劑(8.0 mmol/L)加到4 mL上述蛋白溶液中，選擇激發波長365 nm，發射波長484 nm，測定不同濃度樣品蛋白的熒光強度，以熒光強度對蛋白質濃度作曲線，將曲線的最開始的斜率定義為被檢測樣品的表面疏水度H0。

1.3.6 SDS-PAGE電泳

參照Wang[22]的方法并稍作修改，選用12%的分離膠(pH 8.8)和5%的濃縮膠(pH 6.8)。將蛋白樣品溶于0.125 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)的緩沖液(含5% SDS、10% β-巰基乙醇、20%甘油和0.5%溴酚藍)中，配制成20 mg/mL的樣品溶液。而后在沸水浴中煮沸5 min，7 000 r/min離心15 min，取上清液10 μL上樣。電泳過程采用恒壓模式，電泳結束后，將凝膠分別進行考馬斯亮藍R-250染色和PAS(Perodicacidschif)反應染色，脫色液脫色，最后進行拍照，觀察亞基條帶變化。

考馬斯亮藍R-250染色方法：電泳凝膠在0.1%的考馬斯亮藍R-250溶液中染色1 h，而后置于甲醇∶冰醋酸∶水=1∶1∶8的脫色液中脫色，直至背景色脫去。

PAS染色參照Guan[23]和王玉琪[24]的方法并稍作修改。將凝膠先用10%三氯乙酸進行蛋白固定25 min，蒸餾水沖洗2～3次。然后用高碘酸室溫氧化15 min，蒸餾水洗滌2～3次，加入Schiff試劑避光染色1 h，染色結束后，采用0.5%的偏重亞硫酸鈉(現用現配)洗滌干凈，于醋酸溶液保存。

1.3.7 紅外光譜分析

（三）無論是對于自然界，還是實際生活中的化學物質、現象，都應保持必要的探究欲、好奇心，使自身的學習興趣得到進一步的拓展；促使物質觀的初步建立，懂得世界應是物質的，而物質又是變化的，能用辯證思維來看待事物本質，摒棄一些迷信觀念，使得崇尚科學的思想得以樹立等。

準確稱取2 mg樣品，按照1∶100的比例加入溴化鉀，經研缽研磨后壓制成薄片，采用傅里葉紅外光譜儀進行全波段掃描(400～4 000 cm-1)，掃描次數32次。

1.3.8 熒光光譜分析

參照文獻[25]的方法稍作修改。將復合改性的樣品溶于0.2 mol/L pH 8.2磷酸鹽緩沖液中，配制成蛋白濃度為5 mg/mL的樣品溶液，離心(8 000 r/min，10 min)，取50 μL上清液于石英比色皿中，使用熒光分光光度計在激發波長280 nm、狹縫寬5 nm的條件下，測定樣品蛋白在300～500 nm范圍內的熒光發射光譜。

1.3.9 數據處理

所有的實驗均至少進行3次重復，數據以平均值±標準差的形式表示。數據的顯著性(P<0.05)通過SPSS軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 接枝度測定

接枝度是測定溶液中游離氨基的變化，常被用來反映糖基化反應蛋白質中的游離氨基和還原糖中的羰基的共價結合的程度[26]。不同微波功率處理結合糖基化復合改性小麥面筋蛋白的接枝度變化如圖1所示。

圖1 微波功率對復合改性小麥面筋蛋白接枝度、褐變程度和中間產物含量(A294)的影響

由圖1可知，在0～350 W時，小麥面筋蛋白的接枝度隨著微波功率的增加而增大，當微波功率為350 W時，小麥面筋蛋白的接枝度達到最大。這是由于經過微波處理后，小麥面筋蛋白的致密結構被破壞，暴露出更多的糖基化反應位點，有利于糖基化反應的發生。當微波功率大于350 W時，接枝度反而下降。因此，適度的微波處理有利于糖基化反應的發生，使接枝度增大。

2.2 褐變程度及中間產物測定

由圖1可知，隨著微波功率的增大，反應體系在294 nm處的吸光值呈現出先增大后減小的變化，在微波功率為350 W處的吸光值最大；當微波功率大于350 W時，吸光值減小，這是由于功率過大，使得已經松散的小麥面筋蛋白結構重新聚集，導致糖基化反應受阻，中間產物(A294)生成量減少。而反應體系在420 nm處的吸光值呈現出不斷增大的趨勢，這可能是由于糖基化反應是一個復雜連續的反應過程，不斷發生糖基化反應產物間的加成或聚合反應，生成更多的類黑精物質，從而吸光值不斷增大。

2.3 復合改性對小麥面筋蛋白溶解性的影響

蛋白質可應用性的重要參考指標之一就是溶解性，溶解性的好壞也會影響蛋白質的其他功能性質，如乳化性、起泡性、凝膠性和流變學特性等。微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白在不同pH條件下的溶解度如圖2所示。

從圖2a可以看出與未經微波處理的小麥面筋蛋白相比，微波處理小麥面筋蛋白的溶解性明顯提高(P<0.05)，且隨著微波功率的增大呈現先增大后減小的變化，這是由于適當的微波處理小麥面筋蛋白能夠減弱蛋白分子間/分子內的非共價作用，致使小麥面筋蛋白結構變得松散，溶解性增大。由于蛋白結構變松散，使得更多的糖基化反應位點得以暴露，從而促進糖基化反應的發生，同時引入更多含有親水羥基的糖鏈，提高了糖基化產物的溶解性[27]，這也是在相同pH條件下，微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白的溶解性較微波處理小麥面筋蛋白的溶解性顯著提高(P<0.05)的原因。由圖2b中也可以看出小麥面筋蛋白經糖基化改性后等電點發生向左偏移的變化，這可能是因為小麥面筋蛋白共價交聯含有多羥基的葡萄糖，與游離氨基共價交聯使其電荷發生變化，從而導致等電點發生變化[28]。

圖2 微波處理及微波-糖基化復合改性對小麥面筋蛋白溶解性的影響

2.4 復合改性對小麥面筋蛋白乳化特性的影響

微波處理和微波-糖基化復合改性對小麥面筋蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響如圖2.3所示。

由圖3可知，未改性的小麥面筋蛋白的乳化活性和乳化穩定性分別為9.03 m2g-1和4.59 min。微波處理后小麥面筋蛋白乳化活性和乳化穩定隨著微波功率的增大呈現先增大后減小的趨勢，在微波功率為350 W時達到最大，為41.65 m2g-1和11.99 min。對比可以看出，小麥面筋蛋白經微波-糖基化復合改性后，其產物乳化活性和乳化穩定性顯著提高(P<0.05)。有報道稱小麥面筋蛋白乳化特性增加與蛋白質溶解性的增加，以及疏水性基團暴露程度增加有關[29]。Dickinson等[30]研究表明：無表面活性的親水性糖分子可以通過增強蛋白膜的厚度來提高蛋白的乳化性和乳化穩定性。微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白的乳化活性提高，這是由于當葡萄糖以共價鍵連接入小麥面筋蛋白肽鏈中，增加了空間阻力，使得界面蛋白很難發生聚合，從而提高其乳化穩定性。而過度的預處理，就會使得蛋白分子重新聚集，糖基化反應減弱，乳化活性也隨之降低。

圖3 微波功率對糖基化小麥面筋蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響

2.5 SDS-PAGE電泳分析

將小麥面筋蛋白-葡萄糖糖基化產物進行SDS-PAGE電泳分析，分別采用考馬斯亮藍法、PAS法進行染色以表征蛋白質及糖蛋白。微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白的電泳圖如圖4所示。

圖4為不同功率微波-糖基化小麥面筋蛋白產物的電泳圖，不難看出，小麥面筋蛋白經過微波-糖基化改性后，有較大分子量的聚合物生成。這可能是因為熱處理過程中，小麥面筋蛋白的亞基產生聚集，形成了分子量更大的聚合物。該聚合物不能順利通過濃縮膠和分離膠，因此在P1處出現黑色條帶，這與程熙茜[31]的電泳結果相一致。經過對凝膠進行PAS染色發現，在P1和P2處有紅色的條帶顯現，這說明小麥面筋蛋白與葡萄糖發生了共價交聯，生成了糖蛋白。且紅色條帶的顏色隨著微波功率的增大而出現先增大后減小的變化，當微波功率為350 W時，紅色條帶顏色最深，這說明此時生成的糖蛋白量最多。這與之前接枝度的測定結果相一致。

注：M為蛋白質標品，1為天然小麥面筋蛋白，2～7分別為0、70、210、350、560、700 W的微波-糖基化復合改性的小麥面筋蛋白。圖4 復合改性小麥面筋蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖譜

2.6 表面疏水性分析

表面疏水性可以反映蛋白的空間構象變化。微波處理和糖基化改性對小麥面筋蛋白表面疏水性的影響如圖5所示。

圖5 微波處理及糖基化改性對小麥面筋蛋白表面疏水性的影響

由圖5可看出，經微波處理后，小麥面筋蛋白的表面疏水性顯著增加，但微波功率超過350 W后，其表面疏水性開始降低，這是由于適當的微波可以使物料內部分子間發生摩擦，破壞分子間的共價鍵/非共價鍵[32]，使小麥面筋蛋白結構變得松散，內部的疏水區域增多。而當微波預處理的小麥面筋蛋白經過糖基化改性后，小麥面筋蛋白分子與含有較多親水性羥基的糖鏈發生共價交聯，蛋白質的親水性增強，表面疏水性降低。

2.7 紅外光譜分析

微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白的傅里葉紅外光譜如圖6所示。

圖6 復合改性小麥面筋蛋白樣品的紅外光譜圖

由圖6可以看出，微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白產物的紅外光譜圖中各吸收峰強度較僅糖基化改性的小麥面筋蛋白均有不同程度的增加，且微波功率為350 W時的吸收峰強度最大。由紅外圖譜分析發現，當小麥面筋蛋白經過糖基化改性后，其分子結構發生了改變，具體反映為小麥面筋蛋白功能基團的變化。如3 367 cm-1處的吸收峰增強，這可能是因為糖基化反應過程中，葡萄糖分子的共價交聯，從而出現游離羥基在3 700～3 200 cm-1處的伸縮振動，這同時也說明適當的微波功率可以促進糖基化反應的發生，使小麥面筋蛋白與葡萄糖發生共價交聯反應[33]，這與Sun[34]等研究結果一致。

位于1 700～1 600 cm-1范圍的酰胺Ⅰ帶經常被用來分析蛋白質的二級結構，如α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲[35]，通過對紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶進行去卷積，二階導數擬合后，計算出微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白的二級結構含量如表1所示。

由表1可知，微波-糖基化復合改性小麥面筋蛋白樣品中α-螺旋含量顯著下降，在微波功率為350 W時，α-螺旋含量降到最低。這是由于穩定α-螺旋的作用力主要是多肽鏈的氫鍵，而微波處理和糖基化改性影響了氫鍵的穩定。此外α-螺旋含量隨著微波功率的上升呈現出不同的變化，表明適當的微波處理可以改變小麥面筋蛋白的空間構象，促進糖基化反應。同時，二級結構中的β-折疊和無規則卷曲結構的含量上升，進一步說明微波-糖基化復合改性改變了小麥面筋蛋白的二級結構，部分α-螺旋結構轉換為β-折疊和無規則卷曲結構。由于β-結構和無規則卷曲結構較α-螺旋結構的穩定性差，從而使得蛋白質的靈活性增強。Kato等[36]指出蛋白分子柔性越大，乳化性越好，因而微波-糖基化改性能夠改善蛋白質的溶解性和乳化性等功能特性。

表1 復合改性小麥面筋蛋白樣品二級結構的變化

注：同一列中不同小寫字母代表具有顯著性差異(P<0.05)

2.8 熒光光譜分析

熒光光譜是一種有效分析研究蛋白空間構象的技術手段[37]。由于糖基化反應過程會產生具有熒光特性的產物，所以可以通過分析熒光光譜來表征小麥面筋蛋白糖基化產物的結構。

圖7 不同微波功率處理小麥面筋蛋白糖基化產物的熒光光譜的變化

由圖7可知，復合改性小麥面筋蛋白在354 nm處有最大熒光吸收，這驗證了小麥面筋蛋白糖基化產物具有熒光性。先前的報道稱[35]糖基化反應所產生的熒光物質主要來源于氨基化合物的Streeker降解或是糖基化反應中間產物的進一步反應形成的。由圖7可看出，微波-糖基化改性小麥面筋蛋白的熒光強度高于單獨糖基化改性的小麥面筋蛋白，且隨著微波功率的增加，復合改性小麥面筋蛋白樣品的熒光強度呈現先增加后降低的變化，當微波功率為350 W時熒光強度最大，表明適當的微波功率可以促進糖基化反應進程，加快糖基化反應速度。

3 結論

研究微波處理和糖基化改性對小麥面筋蛋白功能特性及結構的影響。結果表明：適當的微波處理結合糖基化復合改性小麥面筋蛋白，可以提高其溶解性及乳化特性，當微波功率為350 W時，溶解性最大，且乳化性及乳化穩定性最好，分別為41.65 m2g-1和11.99 min；適當的微波預處理能夠使小麥面筋蛋白的結構變得松散，疏水基團暴露，提高其表面疏水性，而與糖接枝后，由于引入了較多的親水性羥基，又導致表面疏水性下降；SDS-PAGE電泳、傅里葉紅外光譜及熒光光譜分析表明小麥面筋蛋白與葡萄糖發生了共價交聯，且微波預處理對小麥面筋蛋白糖基化反應具有促進作用。