不同大小遼東櫟種子的脫水敏感性

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(國家民委生態系統建模及應用重點實驗室,北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021)

Roberts根據種子在貯藏過程中的行為表現，把種子分為正常性種子和頑拗性種子2種類型[1]；正常性種子在母體植株成熟散落前經歷一個脫水過程，脫落時含水量較低，但種子仍保持較高活力；頑拗性種子在成熟過程中不經歷脫水階段，成熟散落時具有較高的含水量和代謝活性[2]，一旦脫水，活力大大降低。種子含水量可作為評價頑拗性種子脫水耐性的指標，被廣泛應用于頑拗性種子生物學領域的研究[3-4]。頑拗性種子的脫水耐性在一定程度上取決于其頑拗性程度，且其脫水耐性與脫水速率呈正相關，因為在快速脫水條件下，種子遭受脫水脅迫的時間縮短也可減少代謝脅迫的積累[5]，慢速脫水使水分在種子內部保持的時間和導致種子傷害的劣變過程延長，從而加重對種子造成的傷害[6]，例如，木菠蘿(ArtocarpusheterophyllusLamk.)種子的胚軸在快速脫水和慢速脫水至含水量約0.37 g/g干重時，快速脫水時存活率仍高達100%，而慢速脫水時存活率則降至0[7]，然而也有種子活力與種子脫水速率無關的報道[8]。生產頑拗性種子的植物在長期進化過程中，其母體植株可通過調整結實量而產生不同大小的種子，大小不同的種子可在一定程度上改變種子表面積以調節吸水率和失水率，從而適應環境變化[9]，因此，不同大小種子的脫水耐性可能存在一定差異，并對種子活力產生影響。

遼東櫟(Quercuswutaishanica)是我國暖溫帶落葉闊葉林的優勢樹種之一，對群落的外貌、結構、動態和種類組成具有重要影響?；诜N子繁殖的實生更新在維持遼東櫟遺傳多樣性和群落穩定性等方面具有重要作用。包括遼東櫟在內的所有櫟屬植物的種子都表現出一定程度的頑拗性[10]，遼東櫟種子在沙埋和風干后貯藏30 d對種子活力不會造成嚴重影響，屬于輕度頑拗性種子[11]，但在種子脫水耐性及其對活力的影響方面還缺乏系統研究，尤其是不同大小遼東櫟種子的脫水耐性還沒有引起足夠重視。本研究以取自六盤山區的不同大小遼東櫟種子為材料，在緩慢(室溫自然風干)和快速脫水(硅膠脫水)條件下，定期對種子進行含水量和活力測定，研究不同大小遼東櫟種子的脫水敏感性。研究結果可為探索遼東櫟種子的長期貯藏方法及種苗繁育等生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子采集

試驗用遼東櫟種子于2017年9月采自寧夏六盤山國家自然保護區(35.15°N～35.41°N，106.9°E～106.30°E)龍潭林場內30年生以上的遼東櫟植株冠層下，采集后于次日帶回實驗室，采用觀察結合手捏的方法挑選出足量的飽滿、無蟲蛀遼東櫟大、小種子備用，大種子和小種子鮮重分別為(3.05±0.38)g和(1.46±0.27)g。

1.2 種子脫水和含水量測定

緩慢脫水：分別取上述挑選好的遼東櫟大、小種子各1 120粒，平均分為8組作為8個不同脫水時間處理，每組再分為4個小組作每一脫水時間的4次重復，每小組種子共35粒；將種子單層平攤于室溫約25 ℃實驗室內的實驗臺上自然風干，分別在脫水后的6，12，24，36，72，120，168 h (7 d)和336 h (14 d)，各取1組種子進行含水量和活力測定。每重復取5粒種子用于含水量測定，用電子天平稱其鮮重后，再用單面刀片切成約1 mm厚薄片，裝入稱量瓶中，置于103 ℃烘箱中烘干24 h后稱重，以干重(dry weight,DW)表示種子含水量(g/g)；每重復其余30粒種子用于活力測定。種子含水量和活力測定均以采集后貯藏于4 ℃冰箱內未進行脫水處理(0 h)的種子作為對照。

快速脫水：取大小為20 cm×15 cm自封袋64個，平均分為2組，在袋內裝入烘干的變色硅膠后，分別裝入上述挑選好的遼東櫟大、小種子(種子與硅膠的質量比約1/10)，每袋裝入35粒種子，將種子單層擺放，以保證種子與硅膠充分接觸；將自封袋置于室溫約25 ℃實驗室內干燥器中，硅膠吸水顏色變淺時及時更換。分別在脫水處理1，2，4，8，12，24，48 h和72 h后，取出大、小種子各4袋作為4次重復，分別進行種子含水量和種子活力測定，每袋內取5粒種子用于含水量測定，測定方法和含水量計算方法同上；每重復其余30粒種子用于活力測定。對照同緩慢脫水。

1.3 種子活力測定

種子萌發于14 h光照/10 h黑暗[光照強度約140 μmol/(m·s)]，“白天”溫度為25 ℃，“夜晚”溫度為15 ℃條件下進行，將種子進行剝皮處理后播種于內徑為12 cm，裝有約1.5 cm厚濕沙(用前以清水洗凈后于103 ℃烘箱中烘干48 h)的培養皿中；播種時將種子平放于濕沙表明，輕壓種子使種子與濕沙充分接觸以利于種子吸水。播種后將培養皿置于SPX-330-C智能人工氣候箱(上海瑯玕設備有限公司)中，每24 h觀測萌發種子記錄1次，以胚根伸出5 mm為萌發標準，記錄萌發種子數，并測定萌發種子胚根長度。種子萌發過程中適時澆水，保持沙子濕潤，觀察記錄至連續2周沒有種子萌發為止。

1.4 萌發參數計算

評價種子活力的參數包括萌發率(germination percentage,GP)、萌發速率(germination rate,GR)、萌發指數(germination index,GI)和活力指數(vigor index,VI)，分別按照以下公式計算：

GP=(萌發種子數/試驗用種子總數)×100%；

GR=∑(100Gi/nti) ,式中：n為每處理使用的種子數，Gi為ti(ti=0，1，2，3…，∞)天萌發的種子數;

圖1 緩慢脫水(A)和快速脫水(B)對不同大小遼東櫟種子含水量的影響

表1 種子大小和脫水方法對遼東櫟種子萌發影響的二因素方差分析

GI =∑Gt/Dt，式中：Gt為時間t天的萌發種子數，Dt為萌發試驗天數；

VI=萌發率×[幼苗根的長度(cm)+幼苗莖長度(cm)](本研究只計算胚根長度)。

1.5 數據統計分析

用多因素方差分析(Multi-way ANOVA)的方法分析種子大小和脫水方法對萌發參數影響的差異顯著性；用單因素方差分析(One-way ANOVA)的方法分析不同脫水階段和同一時期不同大小種子之間各萌發參數的差異顯著性。所有數據的統計分析均在SPSS 21.0軟件中進行。

2 實驗結果

2.1 種子含水量變化

由圖1可以看出，不同大小遼東櫟種子在成熟散落時均具有較高含水量(分別為1.03，1.00 g/g)，不同大小種子間差異顯著(p<0.05)，且大種子含水量在整個脫水過程中始終顯著高于小種子(p<0.05)。含水量在緩慢脫水6 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后，大、小種子含水量分別為0.58 g/g和0.47 g/g (圖1 A)。種子含水量在快速脫水1 h后即顯著降低(p<0.05)，大種子含水量在快速脫水過程中始終顯著高于小種子(p<0.05)，除在脫水12 h與24 h間無顯著差異外，其他脫水階段間均差異顯著(p<0.05) (圖1 B)。

2.2 種子大小和脫水速率對種子萌發的影響

種子大小對所有萌發參數均無顯著影響，脫水方法對活力指數影響顯著(p<0.05)，但對其他萌發參數無顯著影響，種子大小和脫水方法間的交互作用對所有萌發參數的影響均未達顯著水平(表1)。

2.3 不同脫水處理種子的萌發率及其與含水量的關系

從圖2可以看出，未脫水時大、小種子萌發率差異不顯著；大種子經緩慢脫水12 h含水量為0.94 g/g時，萌發率提高至100%，但在脫水120 h后顯著降低(p<0.05)；輕度脫水對小種子萌發也具有促進作用，脫水24 h后含水量為0.86 g/g時，萌發率提高至97.5%，而在脫水36 h后含水量為0.73 g/g時萌發率仍與未脫水種子持平；大、小種子萌發率分別在脫水120 h和72 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后分別降至66.7%和42.5% (圖2 A、圖2 B)。除脫水6 h、24 h和36 h外，其他脫水階段大種子萌發率均顯著大于小種子(p<0.05)。

在快速脫水條件下，輕度脫水也可促進種子萌發，一直持續到脫水24 h (大、小種子含水量分別為0.78 g/g和0.74 g/g)，但脫水48 h后，大、小種子萌發率分別大幅降低至86.7%和69.2% (p<0.05)，均顯著低于對照(p<0.05)，且大種子萌發率均顯著大于小種子(p<0.05) (圖2 C、圖2 D)。

不論是緩慢脫水還是快速脫水，不同大小種子的萌發率均與含水量呈顯著的二次曲線關系(p<0.05)，即在2種脫水條件下，不同大小種子的萌發率均隨含水量的減少而呈降低趨勢(圖2 B、圖2 D)。

注：y1、y2分別表示大種子和小種子含水量與萌發率間的回歸方程。圖2 緩慢脫水和快速脫水條件下不同大、小遼東櫟種子的萌發率及其與含水量的關系

表2 脫水對不同大、小遼東櫟種子的萌發速率、萌發指數和活力指數的影響

注：同行中相同萌發參數的不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 不同脫水處理種子的萌發速率、萌發指數和活力指數

由表2可以看出，未脫水大、小種子的萌發速率差異顯著(p<0.05)；不論是緩慢脫水還是快速脫水，大、小種子萌發速率在脫水前期階段均快速降低；大、小種子萌發速率在緩慢脫水自24 h至脫水36 h和快速脫水自24 h至脫水48 h均大幅降低(p<0.05)。大種子萌發速率在緩慢脫水的多數階段均不同程度地大于小種子，但不同大、小種子間僅在脫水的最后階段(336 h后)差異顯著(p<0.05)；在快速脫水過程中，大種子萌發速率始終大于小種子，不同大、小種子間的差異在脫水48 h后達顯著水平(p<0.05)。

在緩慢脫水24 h前的各階段，大、小種子萌發指數緩慢降低，脫水36 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后，大、小種子萌發指數分別為1.23和0.76。萌發指數在快速脫水4 h前期略有波動，但在脫水8 h后均大幅降低(p<0.05)，脫水72 h后分別為2.06和1.78。未脫水時大種子萌發指數顯著大于小種子(p<0.05)，不同大、小種子間的差異在脫水后期階段達顯著水平(p<0.05)。

在緩慢脫水72 h前，活力指數呈波動性增大趨勢，大、小種子分別在脫水72 h和12 h后最大，脫水120 h后大幅降低(p<0.05)。不同大、小種子的活力指數在快速脫水24 h前均顯著增大(p<0.05)，大、小種子分別在脫水2，4 h后最大，但在脫水48 h后均大幅減小(p<0.05)。未脫水大、小種子的活力指數差異顯著(p<0.05)，在緩慢脫水72 h后的各脫水階段和多數快速脫水階段，大種子均顯著大于小種子(p<0.05)。

3 討 論

頑拗性種子對脫水反應敏感的主要原因可能與其缺乏正常性種子所擁有的代謝關閉機制有關，即在發育過程中未經歷成熟脫水階段，成熟散落時仍具有較高含水量和代謝活性，且已啟動萌發過程[2,12]。研究發現，大、小遼東櫟種子在成熟散落時均具有較高含水量(分別為1.03，1.00 g/g)和萌發率(分別為97.5%，95.8%)，盡管萌發率和活力指數在脫水前期有一定程度提高，但不論是緩慢脫水還是快速脫水，隨著脫水時間的延長，所有萌發參數均在脫水后期階段顯著減小，即表現出頑拗性本質[1,4]。頑拗性種子的含水量可能存在臨界值，一旦含水量低于這一臨界值，種子活力迅速下降。例如，滇南紅厚殼(Calophyllumpolyanthum)種子脫落時含水量達鮮重的45%，當含水量降至30%以下時，存活率迅速下降[13]。本研究發現，遼東櫟大種子在緩慢脫水336 h和快速脫水72 h后至含水量(0.58 g/g)一致時，萌發率仍相對較高(分別為66.7%，79.1%)，而小種子在緩慢脫水120 h和快速脫水72 h后至含水量(0.52 g/g)一致時，萌發率分別為70.8%和66.7%，即在緩慢脫水和快速脫水間發生了逆轉，表明不同大、小種子的臨界含水量可能存在差異。但由于本研究沒有設計更長時間的脫水處理，還難以準確界定其臨界含水量范圍，有待于進一步深入研究。

輕度脫水可通過破壞種子內萌發抑制物的合成或開啟某些與萌發相關的代謝過程而促進種子萌發[14]，即輕度脫水可終止與種子發育相關的合成過程而加速種子后熟，從而開啟萌發啟動的“開關”。本研究中，在脫水前期階段水分輕度丟失也均促進不同大、小遼東櫟種子的萌發，但隨著脫水時間延長，萌發率和其他萌發參數均持續降低。這可能是輕度脫水促進幼苗建立的適應性反應，因為種子快速萌發可使種子通過伸長的胚根獲得外界環境中的水分，從而緩解脫水傷害。

不同大、小種子的脫水耐性可能存在差異并影響種子活力，生產頑拗性種子的植物可在同一植株內或不同植株間產生不同大小的種子，通過改變其比表面積以在一定程度上適應環境變化[9]。遼東櫟大種子的含水量和萌發率在緩慢脫水和快速脫水過程中始終顯著高于小種子；盡管大、小種子的萌發率僅在脫水后期(脫水48 h)差異顯著，但大種子的萌發速率、萌發指數和活力指數均顯著大于小種子，且不同大、小種子的所有萌發參數在脫水后期均差異顯著，表明大種子的脫水耐性更強，不同大、小種子比表面積的變化可能是產生這一結果的主要原因，因為大種子的比表面積較小，脫水相對較慢，受到的傷害積累也較小[15]。

頑拗性種子的脫水耐性還與脫水速率密切相關，快速脫水可使頑拗性種子在脫水到較低含水量時仍保持較高活力[5,7]，因為水分在種子內部保持的時間越長，脫水傷害對種子發生劣變的影響就越大[6]，快速脫水可縮短種子在中間含水量下停留的時間，從而減少種子代謝脅迫積累[6,16]，已報道的假檳榔(Archontophoenixalexandrae)[16]、木菠蘿[7]和橡膠樹(Heveabrasiliensis)[6]等熱帶地區典型頑拗性種子均對不同脫水速率表現出類似反應。遼東櫟大種子在緩慢脫水120 h和快速脫水48 h后，含水量基本一致時，快速脫水種子的所有萌發參數均不同程度地大于緩慢脫水，尤其在緩慢脫水336 h和快速脫水72 h (含水量均為0.58 g/g)后，后者的所有萌發參數均顯著大于前者，即遼東櫟大種子的脫水行為與上述研究者的結果基本一致。然而，小種子在緩慢脫水120 h和快速脫水72 h后至相同含水量(0.52 g/g)時，萌發參數均在緩慢脫水時更大，類似的結果其他研究也有報道[9]，這可能與不同大小種子的頑拗性差異有關，因為頑拗性種子的脫水耐性是一種具有漸變、過渡和數量特性的復合數量性狀[17]，不同植物種子頑拗性有高度、中度和輕度之分，甚至同一種植物種子也有頑拗性程度的差異[18]。此外，本研究所設置的脫水處理可能還未能脫水至種子臨界含水量，使不同脫水速率對種子萌發率的負面影響在一定程度上被種子的抗氧化系統所抵消[19]，具體機制還有待于進一步深入研究。

綜上所述，輕度脫水促進遼東櫟種子的萌發，但在緩慢脫水和快速脫水條件下，不同大、小遼東櫟種子的活力均隨著脫水時間延長和含水量減少而降低，屬頑拗性種子；遼東櫟大種子的脫水耐性高于小種子，大種子的含水量和萌發率在脫水處理過程中始終顯著高于小種子，且前者的所有萌發參數在脫水處理的后期均顯著大于后者；遼東櫟大種子在快速脫水條件下比在緩慢脫水條件下具有更強的脫水耐性。