PIK3CA rs4975596基因多態性與口腔癌的相關性研究

張永春，王志強，孫晶晶，宋榮學，王冶

口腔癌是世界范圍內普遍存在的惡性腫瘤，流行病學統計結果顯示，世界各地的年發病例數約為263 000例，死亡例數約為128 000例[1-3]。鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔癌最常見的病理類型之一，在中國尤為常見。近年來，腫瘤機制的研究深入，但有效的預防和早期診斷OSCC的措施很少見。由于OSCC復發率高，淋巴結轉移多見，5年生存率低于50%[4]。PI3K催化亞基(PIK3CA)位于3q26.3，編碼1 068個氨基酸，產生124 kD的蛋白質，即PI3K p110催化亞單位α(PI3K p110α)[5-6]。有研究表明，PIK3CA能夠參與腫瘤發生發展的過程，且作為致癌基因[7]。PIK3CA基因突變能夠導致PI3K p110α的功能增強。通過PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，這是激活PI3K/蛋白激酶B( PI3K/AKT)信號通路的重要媒介。為了探討PIK3CA基因多態性與口腔癌發生的關系，現對50例口腔癌病人以及50例健康人群的外周血標本進行分析，以期為臨床口腔癌的治療以及預后提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料赤峰學院附屬醫院于2015年1月至2016年11月期間收治了50例口腔鱗狀細胞癌病人(口腔癌組)以及50例健康人群(對照組)的外周血樣本，其中口腔癌組中男性30例，女性20例，年齡(51.5±5.3)歲，年齡范圍為41～77歲；對照組中男性32例，女性18例，年齡(52.6±6.1)歲，年齡范圍為43～74歲?？谇话┙M與對照組在年齡和性別方面差異無統計學意義(t=0.323，P=0.754；χ2=0.05，P=0.820)，具有可比性。納入標準：經病理活檢確診者。排除標準：(1)有其他癌癥病史；(2)精神異常者。本研究通過赤峰學院附屬醫院倫理委員會批準，病人或近親屬和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 DNA提取 在所有樣本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1.2.2 引物合成 PIK3CA基因正向和反向的引物合成序列見表1，引物由上海烈冰生物技術有限公司合成。

表1 PIK3CA基因多態性檢測的引物設計

1.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 預變性95 ℃ 4 min、變性95 ℃30 s、退火56 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，72 ℃末延伸5 min；共35個循環；酶切體系及條件：10X FastDigest Gren Bufer 2 μL，FastDigestenzyme 1 μL(rs11615使用Eam1105I，rs13181使用AleI)，ddH2O 17 μL，PCR產物10 μL；水浴37 ℃酶切10 min，然后取出立即置水浴65 ℃滅活5 min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45 min，電壓設置為145 V。

1.3統計學方法使用Padgragh 6.0統計軟件進行分析。采用χ2檢驗分析Hardy-Weinberg遺傳平衡定律和兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異。檢驗水準取雙側α=0.05。

2 結果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗PIK3CA rs4975596的AA、AG、GG基因型在對照組的數目分別為34例、12例、4例，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(χ2=0.121，P=0.94)。

2.2PIK3CArs4975596基因型和等位基因頻率的分布由表2結果可知，PIK3CA rs4975596基因多態性均存在三種基因型，對各基因的三種基因型分布經χ2檢驗分析發現口腔癌組PIK3CA rs4975596的基因型分布差異有統計學意義(χ2=7.073，P=0.029)，提示不符合遺傳平衡。而對照組χ2=3.125,P=0.210，提示符合遺傳平衡。

PIK3CA rs4975596的A、G等位基因在口腔癌組的分布頻率分別為65%、35%；在正常對照組的分布頻率分別為76%、24%；兩組間差異有統計學意義(χ2=5.360，P=0.024)。結果見表3。

表2 PIK3CA rs4975596基因型頻率分布/例(%)

表3 PIK3CA rs4975596等位基因頻率分布/例(%)

2.3PIK3CArs4975596多態性與口腔癌發生的關系分析PIK3CA rs4975596基因的基因型與口腔癌的關系時發現PIK3CA的G(突變型)等位基因與A(野生型)等位基因比較，差異有統計學意義(χ2=6.349，P=0.005)，而KIK3CA的GG基因型與AA基因型比較，差異有統計學意義(χ2=5.831，P=0.034)。結果見表4。

表4 PIK3CA rs4975596基因多態性與口腔癌的關系

2.4PCR擴增對PIK3CA rs4975596位點的野生型、雜合突變型和純合突變型三種基因型和樣本進行PCR擴增，2%瓊脂變性凝膠電泳結果顯示，PCR擴增的DNA產物片段大小與預期相同，在91 bp附近，每孔只有一條亮帶，條帶清晰無雜帶，PCR擴增特異性好。見圖1。

圖1 PCR擴增的電泳結果

3 討論

口腔鱗狀細胞的發生、發展是由多種因素參與，通過誘導基因突變、干擾細胞周期調控等機制作用于免疫系統，是協同作用的一個動態過程[8]。這個過程可能涉及多種致癌基因和抑癌基因位點突變、缺失、甲基化和拷貝數的變化等，這些遺傳學改變的累積終將引發口腔鱗狀細胞癌的發生[9]。根據之前的研究報道顯示，PIK3CA參與了腫瘤的發展過程并可作為致癌基因[7]。突變使得基因重復過度活躍，導致PIK3CA出現擴增和PI3Kp110α的增強功能。通過PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，這是激活PI3K/AKT信號通路的重要媒介。PIP3與磷酸肌醇依賴蛋白激酶1(PDK1)的C末端同源性結構域結合，激活PDK1?；罨腜DK1磷酸化AKT的第308蘇氨酸。在此基礎上，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(PDK2)磷酸化AKT的第473位，因此，PI3K/AKT信號通路被激活[10-11]。以前的研究表明，PI3K/AKT信號通路被基因頻繁的突變激活以促進腫瘤生長[12]。PIK3CA的遺傳多態性還與多種癌癥的發生有關，比如頭頸鱗狀細胞癌[7]，食管鱗狀細胞癌[13]，非小細胞肺癌[14]，乳腺癌[5，15]，子宮內膜癌[16-17]，胃癌[18]和直腸癌[19-20]。

本次研究的結果顯示，PIK3CA rs4975596基因型與等位基因頻率分布差異有統計學意義，并且PIK3CA rs4975596 GG基因型和G等位基因與口腔癌顯著相關，說明了PIK3CA rs4975596基因多態性在口腔癌發生過程中是危險因素。本研究中雖然分析了PIK3CA基因型、等位基因與口腔癌發展的關系，但由于樣本量局限，在后續研究中需進一步擴大樣本數量。遺傳多態性在很多癌癥研究中被認為發揮著重要作用。PIK3CA正在成為腫瘤細胞存活的關鍵因素。研究顯示，PIK3CA突變通常出現在腫瘤發生的晚期，就在入侵之前或與入侵一致[18]，說明PIK3CA可能與癌細胞的侵襲密切相關。此外，PIK3CA多態性導致腫瘤組織中PI3K信號通路的增強，也表明PIK3CA可能參與腫瘤形成[13]。因此，建立預測性生物標志物用于早期評估口腔癌是非常有必要的，通過檢測基因多態性的預處理識別能夠指導臨床醫生開展合理地治療，對穩定病人病情非常有幫助。我們的研究提出了PIK3CA基因多態性與口腔癌發生的關聯，并指出了PIK3CArs4975596 GG、等位基因G能夠作為口腔癌發生的危險因素，可以作為早期預防口腔癌的臨床標志物。

綜上所述，口腔癌病人腫瘤細胞中的PIK3CA多態性與口腔癌發生顯著相關，檢測其多態性對早期發現口腔癌有一定價值。