側腦室注射鼠神經生長因子對阿爾茨海默病轉基因模型小鼠學習能力及行為學的影響

李善華，周利，張霞，何華瓊

阿爾茨海默病 (AD) 即老年性癡呆，是老年人常見的一種中樞神經系統隱匿、進行性腦功能衰退性神經疾病。AD病人具有持續進行性的智能衰退的特點，其認知和記憶功能進行性下降，臨床出現智力衰退、進行性癡呆并最終導致人格及性格完全改變，嚴重者生活不能自理，需要長期照顧，增加家庭負擔并嚴重影響病人生存質量[1]。臨床研究表明，鼠神經生長因子(mNGF)具有促進受損中樞神經元生長分化作用，對受損中樞和外周神經元均有營養作用，可通過加速損傷神經纖維及軸索的再生來促進損傷神經功能的恢復[2-3]。鑒于mNGF在臨床應用治療AD已取得了一定的療效，但其缺乏相關的動物研究，特別是電生理結合學習記憶能力方面的研究，本實驗于2017年5—8月通過側腦室注射mNGF，采用膜片鉗記錄技術和國內外公認的行為學檢測方法來觀察和研究其治療AD轉基因模型小鼠作用，分析作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物AD轉基因模型小鼠20只(C57BL/6J)，老年正常C57BL/6J小鼠10只，均為雄性，體質量(20.0±1.0)g，周齡為7周。動物基線資料如性別、體質量和周齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。動物均購自北京醫科利昊生物科技有限公司 [許可證SYXK(鄂)2017-0031]。將20只老年癡呆轉基因小鼠(C57BL/6J)采用隨機數字表法分為AD組和實驗組，每組10只，另取10只老年正常C57BL/6J小鼠設為老年組作為對照。遵偱3R原則(替代、減少、優化)，實驗過程中充分保證動物福利、給予動物人道關懷。動物自由飲水并飼以顆粒飼料，動物房12 h交替光照，相對濕度保持在75%左右，恒溫(22～24)℃。動物處置也符合倫理學原則。

1.2儀器與試劑Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統WMT-100(成都泰盟軟件有限公司，型號：WMT-100)；鼠腦立體定位儀(上海玉研科學儀器有限公司)；玻璃電極拉制儀(日本 Narishige 公司，型號：PP-83)；膜片鉗放大器 (英國 Campden 公司，型號：Mul-ticlam p700A )，振動切片機(英國Campden公司，型號：752M)；注射用mNGF(廈門北小之路生物工程有限公司,批號:017082408)；小鼠腦源性神經營養因子(BDNF) 和神經生長因子 (NGF)；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司)。

1.3給藥方法將實驗組小鼠麻醉后固定于小鼠立體定位儀，用微量注射器將20 μL 注射用mNGF準確注射于側腦室內，間隔10 d注射一次，共注射3次。老年組注射等量0.9%氯化鈉注射液作為對照，治療同實驗組。

1.4海馬回腦薄片的制備及全細胞膜片鉗記錄方法參照文獻[4]，先將人工腦脊液通95%O2+5%CO2飽和并放入冰箱(4 ℃)備用。小鼠用斷頭器斷頭，咬骨頭鉗去頂骨，迅速分離出小腦組織，置于 4 ℃ 95%O2+5%CO2飽和人工腦脊液中浸泡5 min，修整海馬回區域，用振動切片機切成約300～400 μm厚度的海馬回腦薄片。然后在人工腦脊液中用針頭分離出海馬回CA1區，再孵育 1 h備用。參照文獻[5]，用Mul-ticlam p700A 膜片鉗放大器進行全細胞膜片鉗記錄海馬CA1區群峰電位(PS)和自發性動作電位 (AP)，記錄的PS和AP采用Pclamp軟件分析。記錄前先用PP-83 控制儀拉制玻璃微電極( 直徑約1～2 μm )，微電極用pH為7.2標準電極內液充灌30 min，灌前用0.22 μm濾膜過濾后，使充灌后的微電極內封接電阻為 2～6 MΩ。海馬CA1區全細胞膜片鉗記錄在20～25 ℃的室溫下進行，記錄時將備用海馬回CA1區腦薄片移入浴槽中，用恒流泵持續灌注95%O2+5%CO2混合人工腦脊液，然后推進微電極，使微電極尖端與細胞膜形成巨阻抗，封接成功后抽吸破膜(負壓破膜使電極內液與細胞內液相通)即可形成全細胞記錄。

1.5BDNF和NGF蛋白檢測參照文獻[6]，取給藥前后分離好的海馬回CA1區腦薄片，采用免疫組化法檢測腦薄片蛋白陽性表達。先將標本石蠟包埋后切片、烤干、脫蠟，滴一抗(BDNF)，4 ℃ 過夜，陰性對照滴加磷酸緩沖鹽(PBS)溶液。隔日后室溫下復溫，滴二抗工作液，37 ℃孵育10 min，辣根酶標記 10 min；用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，然后分化、返藍、脫水、封片。高倍鏡下隨機取10個視野，各計數100個細胞，分別計算BDNF和NGF蛋白陽性表達。腦薄片SP染色后BDNF和NGF蛋白陽性為胞漿棕黃色或黃褐色。用圖像分析軟件統計各組平均光密度 (MOD)值。

1.6實時定量聚合酶鏈式反應(PCR) 取分離好的海馬回CA1區腦薄片，一步法提取腦薄片總RNA，取1μg總RNA，用AMV反轉錄酶進行反轉錄，反轉錄產物PCR擴增，以β-actin為內參，檢測BDNF和NGF mRNA表達。引物序列見表1。PCR反應條件為：93 ℃ 30 s、94 ℃ 3 min、64 ℃ 30s、71 ℃ 1 min，35個循環，71 ℃ 7 min。以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比表示BDNF和NGF mRNA的相對值[7]。

表1 引物序列表

1.7Morris水迷宮實驗在鼠神經生長因子側腦室注射前和第40天進行 Morris 水迷宮空間探索實驗，測試時隨機選取四個象限中的任意一點，將小鼠頭向上，面向池壁放入水中，記錄小鼠 60 s內穿越原平臺次數，用空間探索實驗來觀察大鼠運行軌跡來評估大鼠學習和記憶能力(評估4次取均值)[8]。

2 結果

2.1mNGF對小鼠腦薄片海馬回CA1區BDNF、NGF蛋白陽性表達的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區BDNF、NGF蛋白陽性表達無明顯變化。治療前，AD組和實驗組小鼠BDNF、NGF均低于老年組(P<0.05)。治療第40天，AD組低于老年組(P<0.05)，實驗組小鼠BDNF和NGF蛋白陽性表達則明顯升高，與AD組和治療前同組比較差異有統計學意義(P<0.05)。具體數據見表 2。

2.2mNGF對小鼠腦薄片海馬回CA1區BDNFmRNA、NGFmRNA表達的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區BDNF mRNA、NGF mRNA無明顯改變。AD組和實驗組小鼠治療前后BDNF mRNA、NGF mRNA均低于老年組(P<0.05)。治療第40天，實驗組BDNF mRNA、NGF mRNA表達明顯提高，與AD組和治療前同組比較差異有統計學意義(P<0.05)。具體數據見表3。

2.3mNGF對小鼠全細胞膜片鉗記錄海馬CA1區PS和AP結果的影響老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區PS和AP膜電位保持在正常水平，且治療前后無明顯改變。AD組小鼠治療前后PS和AP膜電位均高于老年組(P<0.05)。實驗組小鼠治療前PS和AP膜電位高于老年組(P<0.05)，治療第40天，PS和AP膜電位降低，與AD組和治療前同組比差異有統計學意義(P<0.05)。具體數據見表4。

表2 小鼠治療前后BDNF、NGF蛋白陽性表達比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表3 小鼠治療前后BDNF mRNA、NGF mRNA 表達比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表4 小鼠治療前后海馬CA1區PS和AP膜電位比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

表5 小鼠治療前后空間探索穿臺次數和定位航行逃避潛伏期比較

注：與老年組比較，aP<0.05；與治療前同組比較，bP<0.05；與AD組比較，cP<0.05

2.4mNGF對小鼠Morris水迷宮測試結果的影響在定位航行試驗中，老年組治療第40天游泳次數和逃避潛伏期與治療前同組比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療前，AD組和實驗組的逃避潛伏期均較老年組明顯延長(P<0.05)。但治療第40天，實驗組逃避潛伏期較AD組明顯縮短，與AD組和治療前同組比較差異有統計學意義(P<0.05)。在空間探索試驗中，各組在撤去平臺60 s后，AD組和實驗組治療前小鼠跨越平臺次數比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療第40天，實驗組小鼠跨越平臺次數明顯高于AD型組(P<0.05)，老年組運動軌跡主要在原平臺位置，AD組則主要分散在外周，而實驗組運動軌跡在兩者之間。具體數據見表5。

3 討論

mNGF是從大鼠頜下腺提取的一類蛋白質，研究表明，mNGF可改善丙烯胺和己二酮致小鼠中毒性周圍神經病肢體運動障礙，可提高受損神經—肌肉動作電位幅度、縮短動作電位潛伏期，對中毒性周圍神經病具有保護作用，可促進損傷神經功能恢復[9]。本實驗通過側腦室直接注射mNGF，減少影響吸收各環節，觀察其對AD轉基因模型小鼠學習記憶能力及行為學的影響，分析可能機制。

在本實驗，實驗組小鼠分3次(間隔10 d)側腦室注射mNGF進行干預性治療，AD組和老年組同時間點注射等量0.9%氯化鈉注射液對照。在治療前和治療第40天用Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統進行定位航行和空間探索實驗；采用全細胞膜片鉗記錄海馬CA1區誘發的PS和AP膜電位；采用免疫組化法檢測小鼠海馬區腦組織BDNF和NGF及其基因表達水平。結果顯示實驗組以上各指標均優于AD組，提示側腦室直接注射mNGF可改善AD小鼠學習記憶能力。

NGF是最早發現的神經營養因子，主要通過遞質乙酰膽堿(Ach)發揮對神經纖維的修復和再生作用，對感覺神經元、多巴胺能神經元、交感神經元和運動神經元等均具有促進存活及保護作用[10-11]。BDNF廣泛存在于神經系統中的一類蛋白質，尤以海馬區含量最為豐富，BDNF對正常神經元的分化、發育、成熟及受損神經元的修復均有促進作用，而大腦海馬區與學習記憶能力密切相關[12-13]。因此，研究mNGF對NGF和BDNF有重要意義。本實驗中，實驗組小鼠腦薄片海馬回CA1區BDNF和NGF蛋白陽性表達及BDNF mRNA、NGF mRNA明顯升高，提示側腦室直接注射mNGF可顯著地調控海馬回CA1區中的BDNF和NGF蛋白陽性表達及BDNF mRNA、NGF mRNA的表達，保護及修復受損的神經元細胞。實驗中我們還觀察到老年組治療前后腦薄片海馬回CA1區PS和AP電位保持在相對正常水平，且治療前后無明顯改變。AD組小鼠治療前后PS和AP膜電位均高于老年組(P<0.05)。實驗組小鼠治療前PS和AP膜電位高于老年組(P<0.05)，治療第40天，PS和AP膜電位降低，與AD組和治療前同組比較差異有統計學意義(P<0.05)。這提示AD轉基因模型小鼠中樞神經系統存在持續性退化性損傷，AD組小鼠腦薄片海馬回CA1區PS和AP膜電位高于對照的老年組，這可能是多巴胺能神經元或膽堿能神經元損傷造成膜電位升高。當側腦室直接注射mNGF后，mNGF可能發揮了抗膽堿酯酶作用，使神經元突觸Ach恢復至正常水平，受損神經元異常升高的膜電位得以恢復，從而減輕異常膜電位對神經元持續性或傷害性刺激，使受損的神經元得以修復。實驗組小鼠跨越平臺次數明顯高于AD型組，但低于老年組，老年組運動軌跡主要在原平臺位置，AD組則主要分散在外周，而實驗組運動軌跡在兩者之間。這說明海馬回CA1區BDNF和NGF蛋白陽性表達及BDNF mRNA、NGF mRNA高表達可改善AD小鼠學習記憶能力和行為學，而mNGF可促進其合成、營養和修復受損神經元[14]。

綜上所述，mNGF能促進AD轉基因模型小鼠學習記憶能力，這對改善其行為學起到促進作用。其作用機制可能與調控海馬回CA1區中的BDNF和NGF蛋白陽性表達及BDNF mRNA、NGF mRNA的表達密切相關。同時，mNGF也可能通過影響膽堿能神經突觸釋放神經遞質Ach，抑制異常膜電位來減輕神經功能損傷和退化，促進AD轉基因模型小鼠腦能量的代謝，修復和營養受損中樞神經來改善AD轉基因模型小鼠學習和認知功能。