雙硫侖聯合銅對肺癌腦轉移癌細胞增殖和遷移的影響*

羅才奎，涂勤，余小祥，孟亮，樊文，陶亮

[武漢大學附屬同仁醫院(武漢市第三醫院)神經外科，武漢 430060]

腦轉移癌是常見的中樞神經系統腫瘤之一，多指原發于身體其他部位的腫瘤通過某種途徑轉移到顱內，并形成新的病灶，轉移癌占顱內腫瘤約10%，20%～40%癌癥患者有顱內轉移，發生年齡與全身腫瘤相同，以40～60歲多見。腫瘤細胞可經多種途徑轉移到顱內，其中以經血流途徑轉移最為常見，如肺癌主要經血流轉移，易在顱內形成多發轉移瘤。腦轉移癌治療可采用手術治療，但轉移瘤存在多發性，有時手術無法完全切除，盡管術后可輔助放射治療(放療)、化學治療(化療)，但患者仍存在復發率高、生存期短、5年生存率低等問題，導致其臨床治療效果不佳。雙硫侖(disulfiram，DSF)也叫戒酒硫，是一種傳統的戒酒藥物，近年來有研究人員研究發現，雙硫侖聯合銅(DSF/Cu)還有抑制腫瘤的作用，能夠殺傷包括黑色素瘤、直腸癌、肺癌、腦膠質瘤、乳腺癌等多種腫瘤細胞[1-3]。筆者在本研究旨在探討DSF/Cu對肺癌腦轉移癌細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試藥 DSF(美國Sigma公司，批號：1110071)、銅鹽(選用CuSO4/Cu2+)(美國Sigma公司，批號：20160302)，肺腺癌腦轉移癌細胞(我院患者手術切除的標本)，細胞計數試劑盒-8( CCK-8) (Dojindo公司，批號：BB18011X)，達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)高糖培養基(批號：L401003)、小牛血清(FBS，批號：20170205)、二甲亞砜(DMSO，Sigma公司，批號：D0798)，細胞凋亡試劑盒(批號：20170408)、丙戊酸鈉 (VPA，批號：20160509)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2儀器 流式細胞儀(Beckman公司，型號：FC500)，高速離心機(型號：3300，日本 Kubota公司)，紫外-可見分光光度計(Beckman公司)，細胞培養箱(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 取肺腺癌腦轉移癌手術后的新鮮離體標本，一部分送常規病理檢查，剩余大小約1 cm×1 cm×1 cm的組織無菌包裹，送入無菌培養間培養。蘇木精-伊紅(HE)及免疫組化檢查證明為肺腺癌腦轉移癌的標本繼續培養。標本的處理應用機械分散法分離細胞。用剪刀將瘤組織剪成碎塊，并將組織碎塊放在注射器內，反復推壓后取出，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液。鏡檢細胞計數、接種培養。用上述分離方法得到的細胞，細胞懸液計數1×106·mL-1，肺腺癌腦轉移癌細胞培養及分組細胞置于含10%FBS和100 U·mL-1青霉素-100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養基中，培養箱環境37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、相對濕度95%，24 h更換培養液，待細胞覆蓋瓶底>95%則用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數生長期的肺腺癌腦轉移癌細胞懸浮于含有10%DMSO、30%FBS和60%DMEM/F12的培養基中，保存在液態氮中備用。實驗時將細胞分為空白對照組(不予任何藥物)、VPA組(VPA 1.0 mmol·L-1)、DSF/Cu組(1，2，3，4，5 mg/0.17 mg)，每個濃度設4個復孔。將空白對照組、VPA組作為陰性對照。

1.2.2CCK-8法檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞增殖的影響 取備用細胞，解凍后置于上述培養基中，用血球計數板計數細胞密度，按5.0×104·mL-1種于96孔板中，孵育24 h，棄去舊的培養液，加入含FBS的新鮮培養液，每孔200 μL，再按上述分組分別加入相應濃度的藥物，均培養72 h。棄去培養液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4，每孔100 μL)和CCK-8溶液(每孔10 μL)，于37 ℃避光孵化1 h，經酶標儀在波長480 nm檢測每組各孔吸光度(A值)，依照公式計算細胞增殖抑制率，抑制率(%)=(1-試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.2.3Transwell小室檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞遷移的影響 用不含血清的DMEM培養液調整各組細胞密度為2.0×105·mL-1，上室加細胞懸液100 μL，下室加DMEM培養液(預先加10%FBS)600 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育，24 h后棄上室培養液，取無水甲醇800μL室溫固定30 min，棉簽輕輕拭去底膜上室側的細胞，用0.1%結晶紫染色15 min，于倒置顯微鏡下計數，取底膜下室側左、右、中、上、下5處高倍視野(×400)的細胞總數，重復3次，并取平均值。

1.2.4Annexin V-PI雙染色法檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞凋亡的影響 按試劑盒說明書操作，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化并收集各組細胞，冷PBS洗滌2次，緩沖液懸浮并調整細胞密度為1×106·mL-1，流式管加入細胞懸液100 μL，分別加入Annexin V 10 μL和碘化丙啶(PI)5 μL，混勻，常溫避光反應15 min，1 h內經流式細胞儀檢測，Ex=488 nm，Em=530 nm，計算總凋亡率。

2 結果

2.1CCK-8法檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞增殖的影響 隨著DSF/Cu藥物劑量不斷增加，其對肺腺癌腦轉移癌細胞增殖的抑制率明顯加強，1 mg/0.17 mg組(29.68±3.12)%，2 mg/0.17 mg組(39.35±4.37)%，3 mg/0.17 mg組(58.84±5.15)%，4 mg/0.17 mg組(60.54±4.24)%，5 mg/0.17 mg組(81.21±6.36)%，空白對照組 (7.10±5.12)%，VPA組 (8.13±4.10)%，差異有統計學意義(P<0.01)，而且DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞增殖的抑制率與藥物劑量呈劑量-效應關系。

2.2Transwell小室檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞遷移的影響 DSF/Cu藥物處理肺腺癌腦轉移癌細胞72 h后，各劑量組肺腺癌腦轉移癌細胞的遷移能力受到明顯的抑制(P<0.05或P<0.01)，而且DSF/Cu藥物對肺腺癌腦轉移癌細胞遷移的抑制能力具藥物劑量依賴性，其中空白對照組遷移(42.3±1.6)個，VPA組(32.1±1.2)個，DSF/Cu1 mg/0.17 mg組(19.1±1.1)個，2 mg/0.17 mg組(11.5±1.8)個，3 mg/0.17 mg組(8.5±1.3)個，4 mg/0.17 mg組(6.3±1.3)個，5 mg/0.17 mg組 (3.3±1.6)個。見圖1。

2.3Annexin V-PI雙染色法檢測DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞凋亡的影響 各劑量的DSF/Cu藥物處理后肺腺癌腦轉移癌細胞的凋亡率明顯增加，VPA組(8.42±2.15)%，DSF/Cu 1 mg/0.17 mg組(11.24±1.34)%，2 mg/0.17 mg組(17.25±1.83)%，3 mg/0.17 mg組(25.67±1.66)%，4 mg/0.17 mg組(31.29±1.19)%，5 mg/0.17 mg組(45.12±1.13)%，與空白對照組 (6.98±1.31)%比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

雙硫侖是一種傳統的戒酒藥物[9]，服用后即使飲用少量的酒，身體也會產生嚴重不適，而達到戒酒的目的。雙硫侖安全，高效，毒性低，近年來有研究人員發現其有著廣泛的抗腫瘤的作用，能夠對包括肺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌、伯基特淋巴瘤等在內的多種腫瘤起到抑制和殺傷作用[10-12]。SKROTT等[13]研究表明雙硫侖具有抗癌活性，并首次確定雙硫侖的抑制癌癥的具體機制：只有正常結構的蛋白質才能發揮其作用，如果細胞在合成蛋白質的過程中出現錯誤的表達以及其空間結構異常，細胞內的泛素蛋白酶系統，p97-NPL4通路就會激活，將異常的蛋白質降解，導致細胞的凋亡。而癌細胞比正常細胞增殖周期、蛋白合成更快，出現異常蛋白質概率也越大[14]，所以癌細胞的存活更加依賴P97-NPL4通路對合成蛋白質的調控，故此激活通路與多種癌癥的生長轉移密切相關[15-16]。在體內癌細胞會比正常細胞產生更多的銅離子[17]，而且雙硫侖的代謝產物具有對癌細胞的特殊靶向性，會更多集中在癌細胞中與銅離子結合形成抗癌復合物，而這種活性復合物又與p97-NPL4通路中的NPL4蛋白結合，抑制其降解異常蛋白質的功能，從而導致癌細胞內功能異常蛋白的積累，最終誘導癌細胞的凋亡[13]。

從本文實驗結果也可以看出，DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞的增殖及遷移起到抑制作用，同時能促進癌細胞的凋亡。由于癌細胞比正常細胞會產生更多銅離子，以及雙硫侖對癌細胞的靶向性，可以推論出雙硫侖對肺腺癌腦轉移癌細胞有靶向抑制作用，其作用機制亦可能與癌細胞p97-NPL4通路被雙硫侖抑制，導致肺腺癌腦轉移癌細胞因細胞內功能異常蛋白質積累而凋亡有關。腦轉移癌患者手術后需輔助放化療，費用高，副作用大，患者痛苦不易接受，有些患者腦轉移癌病灶較多無法完全手術切除，或者無法手術，亦或術后復發，既然本實驗雙硫侖對肺腺癌腦轉移癌細胞有抑制作用，那么雙硫侖對其他類型的腦轉移癌是否也有一定的抗癌作用？具有一定的研究意義，將進一步研究雙硫侖這種古老而且廉價的戒酒藥抑制腦轉移癌的抗癌機制，為其臨床應用治療腦轉移癌提供更充足的理論依據，雙硫侖有望成為聯合治療腦轉移癌的新手段。

A.空白對照組；B.VPA組；C. 1 mg/0.17 mg組；D. 2 mg/0.17 mg組；E. 3 mg/0.17 mg組；F. 4 mg/0.17 mg組；G.5 mg/0.17 mg組

圖1DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞遷移的影響

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.1EffectofDSF/Cuonmigrationofbrainmetastasesfromlungcancer

A.空白對照組；B.VPA組；C. 1 mg/0.17 mg組；D. 2 mg/0.17 mg組；E. 3 mg/0.17 mg組；F. 4 mg/0.17 mg組；G.5 mg/0.17 mg組

圖2DSF/Cu對肺腺癌腦轉移癌細胞凋亡的影響

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.2EffectofDSF/Cuonapoptosisofbrainmetastasesfromlungcancer