干酪中生物活性肽的研究進展

陳森怡 劉振民 焦晶凱

(1. 光明乳業(yè)股份有限公司研究院乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306)

干酪俗稱奶酪，又稱芝士、起司。它是一種以新鮮牛乳為原料，經過巴氏殺菌，添加凝乳酶、發(fā)酵劑，發(fā)酵凝乳切割，成熟等工序制成的新鮮或成熟乳制品[1]。干酪含有豐富的蛋白質、脂肪、氨基酸、維生素、礦物質等成分，是一類營養(yǎng)價值極高的發(fā)酵乳制品[2]。

干酪中乳蛋白經過分解會產生一系列具有活性的水解產物——生物活性肽。生物活性肽是指對人機體具有積極影響并最終影響其健康的特定蛋白質片段[3]，其實這些多肽在親本蛋白質分子的序列中并無活性，但是可以通過腸胃消化、發(fā)酵劑發(fā)酵或者來自微生物或植物的蛋白酶水解釋放出有活性的肽組分[4-6]。它主要是含有2～22個氨基酸殘基的片段，而且不同類型的干酪表現(xiàn)出的生物活性也不同，如免疫調節(jié)、抗高血壓、抗菌、抗氧化和阿片類藥物活性等，這些都與成熟過程蛋白質的水解作用息息相關。多肽不僅可以在成熟階段獲得，而且在人體食用干酪時，胃腸道中的一些蛋白酶會繼續(xù)水解產生新的肽組分，并對機體發(fā)揮一定作用，如對腸道微生物平衡的改善[7]。

1 干酪多肽的產生

干酪的蛋白質含量約25%～35%，且以酪蛋白為主，約占總蛋白含量80%[8]，其中酪蛋白包括α-酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白)、β-酪蛋白、k-酪蛋白；在干酪的制作過程中，酪蛋白的營養(yǎng)價值沒有發(fā)生改變，但在干酪發(fā)酵和成熟過程中發(fā)生了蛋白質消化/水解作用，消化率近100%。通過蛋白質的水解產生了很多分子量大小不一的多肽以及游離的氨基酸，這些水解產物對干酪消化性的改善、降低過敏性以及特色風味的形成有很大的貢獻[9-11]。

在干酪成熟階段，蛋白質的水解過程大致分為兩步：① 一級蛋白質水解，αs-酪蛋白、β-酪蛋白在凝乳酶以及牛乳中原蛋白酶(纖溶酶和組織蛋白酶)的作用下初步水解產生許多大(水不溶性)和中等大小(水溶性)的肽[12]；② 來自發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑的蛋白酶降解中等肽，細胞外、細胞包膜相關蛋白酶有助于水解較大的肽，形成小肽；而肽酶(細胞內)在細胞裂解后釋放，并負責短肽的降解和游離氨基酸的產生[13]。像Prato(普拉托)干酪蛋白初始水解的主要特征是殘留的凝乳酶作用于αs1-酪蛋白的Phe23-Phe24鍵的，β-酪蛋白在成熟過程中較慢降解[14]。不同類型的酪蛋白有不同的水解模式，不同的蛋白酶作用于不同的水解位點，由此釋放出功能各異的生物活性肽[15-17]。

2 干酪多肽的生物活性

2.1 ACE抑制肽

高血壓是心腦血管疾病(CVD)最重要的危險因素[18]，它已經成為威脅人們生命健康的“無形的殺手”，因此高血壓的治療已是迫在眉睫。

人體血壓的調節(jié)依賴于腎素—血管緊張素和激肽—激肽釋放酶系統(tǒng)，血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE) 是兩體系中的關鍵性酶，它是一種與膜結合的二肽羧肽酶，其含維持活性的Zn2+與Cl-[19-20]。ACE可催化血管緊張素I(無活性的十肽)向血管緊張素II(血管收縮因子)的轉化，而使血管收縮；另外ACE可使舒緩激肽(血管舒張因子)轉變?yōu)闊o活性的緩激肽，兩體系協(xié)同作用導致人體血壓的升高[21]。若能抑制ACE的活性，即可達到降血壓的效果。目前臨床合成降壓藥物有卡托普利、賴諾普利等，但這些藥物副作用大，因此當今世界衛(wèi)生保健部門面臨的主要挑戰(zhàn)之一是從天然資源中獲取ACE抑制劑。而干酪已被廣泛地用于研究ACE抑制肽。

1985年，Maruyama 等[22]從酪蛋白胰蛋白酶水解物中分離出具有ACE抑制活性的十二肽(CEI12)，以及起源于β-酪蛋白七肽和五肽，它們在鼠的子宮和回腸的收縮中增強了緩激肽的作用，且其增強效果持續(xù)超過90 min。采用不同的分離鑒定方法獲得氨基酸序列結構各不相同，但同樣具有降壓效果的抑制肽。Bütikofer等[23-24]借助HPLC-MS3技術研究發(fā)現(xiàn)硬質、半硬質、軟質奶酪中均含具有ACE抑制活性的三肽VPP和IPP，但是平均濃度存在一定的差異，且提出牛奶預處理、熱燙條件和成熟時間可能是影響這2種天然多肽濃度的關鍵因素。Stephanie等[25]的研究驗證了成熟期對肽濃度的影響，成熟期越長顯示了更高的ACE抑制活性，另外還指出不同分子量的肽組分IC50值存在差異，相較分子量>10，>5 kDa 的組分，<5 kDa的肽組分具有更強的ACE抑制活性。Hernández等[26]通過凱氏定氮法(Kjeldahl method)，每周取樣以確定酸可溶性氮(ASN)、非蛋白氮(NPN)和乙醇可溶性氮(EtOH-SN)指數，結合分光光度法和HPLC，發(fā)現(xiàn)墨西哥Cotija硬質干酪在成熟結束后達到了100% ACE抑制作用，ACE抑制肽活性與每種氮級分中存在的肽的類型高度相關。眾多αs1-酪蛋白衍生肽以及β-酪蛋白衍生肽(如AYFYPEL、LHLPLP)在不同的干酪(如帕瑪森、布里、高達、哥瑞納干酪)中被鑒定出[27-28]。目前眾多ACE抑制肽的結構序列陸續(xù)被鑒定，但是仍需要進行體內研究以驗證抗高血壓作用。

2.2 抗氧化肽

人體內自由基的產生和清除處在動態(tài)平衡狀態(tài)，當體內自由基過量時，就會發(fā)生氧化反應導致機體發(fā)生多種疾病。研究[29]表明，通過膳食供應是降低機體氧化應激水平的一種現(xiàn)實可行的方法。食源性抗氧化肽由于天然安全、抗氧化性高的特點備受人們的關注，是目前研究較熱的多肽。而干酪由于其富含優(yōu)質的蛋白質也成為人們研究抗氧化肽的一個極好的出發(fā)點。

María等[30]制作干酪時分別添加植物、動物、微生物凝乳酶，發(fā)現(xiàn)添加植物凝乳酶的干酪有更高的抗氧化活性，而且這些抗氧化肽段的N末端中存在更多的疏水性氨基酸(如Val或Leu)，這也可能是造成更高抗氧化性的原因之一。有學者[31-33]在研究抗氧化肽的構效關系中也得出了疏水性的氨基酸是抗氧化肽的特征結構，對自由基清除活性的貢獻更大。對抗氧化肽活性的評估常用DPPH、ABTS自由基清除法。Stephanie等[25]對切達奶酪水溶液進行分級處理得到不同分子量肽組分，發(fā)現(xiàn)分子量>10 kDa的肽組分有更高的DPPH自由基的清除力，其清除率達到13%左右。有研究[34]評估菲達干酪、佩科里諾干酪和洛克福干酪，ABTS自由基清除率為32%～45%，但只有洛克福干酪顯示了DPPH自由基清除活性，而且其抗氧化肽與先前已鑒定的肽有共享序列。Mushtaq等[35]發(fā)現(xiàn)冷藏和室溫條件下對Himalayan奶酪的抗氧化性有顯著性提高，而冷凍條件下無任何的影響，這也間接證明Himalayan奶酪具有潛在的營養(yǎng)功能性，但是其生物利用度有待進一步的研究。

2.3 抗菌肽

抗菌肽是微生物發(fā)酵、酶消化或體外蛋白水解的產物。它們來源安全、無公害，較少會引起細菌的耐藥性，因此廣受國內外研究者的青睞，更加能被消費者所接受。Lima等[36]研究了來自巴西伯南布哥州的Coalho干酪的粗提物，發(fā)現(xiàn)其對糞腸球菌ATCC 6057、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、大腸桿菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853有抗菌效果；并指明大約5 g的干酪便能夠抑制這些病原微生物生長。另研究[37]發(fā)現(xiàn)Coalho干酪中，免疫調節(jié)和抗菌肽多為αs1-酪蛋白衍生肽(f1-23)，這被確定為巴西奶酪權威性的標志。Fialho等[38]借助MALDI-TOF / TOF、MASCOT Daemon與UniProt數據庫結合對肽進行分析，發(fā)現(xiàn)2種新的β-酪蛋白衍生的抗菌肽序列HQPHQPLPPT和MHQPHQPLPPT，但其生物活性未知。Théolier等[39]評估了5種干酪(馬蘇里拉、高達、瑞士、中期、長期成熟切達干酪)的水溶性提取物(WSE)對幾種食源性病原體的抗菌性，在脫鹽和有機酸之前，不同干酪對李斯特菌ivanovii、單增李斯特氏菌、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌O157：H7有不同程度抗菌效果。但經脫鹽純化后，只有馬蘇里拉和高達干酪對李斯特菌ivanovii和大腸桿菌MC4100有明顯的抗菌效果，說明WSE的純化處理對干酪抗菌性有一定影響。另有研究[40-42]發(fā)現(xiàn)肽的疏水性對抗菌活性也有一定的貢獻，而且處理條件(溫度、pH、離子濃度)對抗菌肽活性有顯著影響。目前，關于干酪水溶性提取物的抗菌肽研究頗多，但有關直接食用干酪在體內顯示抗菌效果的研究并不多。

3 干酪活性肽的生物利用與轉化

生物活性肽需經過胃腸道的消化吸收后才能在機體內有效發(fā)揮作用，但胃腸道中的一些蛋白酶的存在是限制其吸收的重要阻礙。生物利用度是指攝取的營養(yǎng)物質或活性物質能夠用于發(fā)揮生理功能或者能夠在體內儲藏，它是評價營養(yǎng)有效性的一個關鍵指標。現(xiàn)在很多關于多肽提取分離、氨基酸序列鑒定及構效關系的研究[40][43]89-90，但是人體攝入的多肽如何在胃腸道中保持穩(wěn)定性，并被人體吸收以發(fā)揮其功能性，是當前研究的重要課題。

Regazzo等[44]研究了牛乳β-酪蛋白具有免疫功能的f(193～209)十七肽，通過Caco-2細胞模型的單層轉運發(fā)現(xiàn)，僅有1%的肽組分能夠被吸收。有些多肽是能夠經胃腸道到達血液發(fā)揮作用。有學者[27，45]對不同類型的干酪進行了體外胃腸道消化試驗，通過消化前后肽譜的對比發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽的類型和總量發(fā)生很大變化，且IC50值降低，說明其抗高血壓活性提高。而且通過Caco-2細胞模型試驗發(fā)現(xiàn)部分ACE抑制肽可被部分吸收。對生物活性肽的研究不僅僅限制于體外模擬試驗，體內研究更加重要，但是有關體內研究數據相對較少。Caira等[46]進行人體試驗，受試者每天攝入100 g奶酪(1 g酪蛋白磷脂肽，CPPs)1周，并在血漿中檢測到酪蛋白磷脂肽CPPs。用含酪蛋白配方食物喂食小鼠2周和4周后，在血漿中檢測到β-酪啡肽(BCM)。

Giacomo等[47]對“Stracchino”軟質奶酪進行了體外消化試驗，通過半制備反相液相色譜(RPLC)分離消化物，發(fā)現(xiàn)釋放的肽中含2種豐富的六肽(EAMAPK和AVPYPQ)在減少氧化細胞應激、抑制ROS釋放和增加抗氧化反應方面表現(xiàn)出顯著的作用。王波[43]31-88利用Caco-2細胞模型研究了肽組分分子量的大小、電荷性、疏水性對多肽生物利用度以及消化吸收中跨轉運路徑的影響，發(fā)現(xiàn)肽組分是弱疏水性時，它的吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度顯著。深入研究經小腸上皮細胞吸收后的生物利用度對多肽的利用有重要的意義。

目前為止，有文獻[48]報道了口服給予分離的蛋白質或肽的耐受性良好，沒有觀察到副作用，因此口服耐受性肽是生成新的營養(yǎng)保健品作為藥物替代品的關鍵點。

4 干酪生物活性肽與腸道菌群關系

胃腸道菌群與機體的健康以及免疫調節(jié)功能息息相關。干酪中的生物活性肽在胃腸道中可作為氮源供微生物利用，對于腸道菌群而言是促進作用還是抑制作用需深入研究發(fā)現(xiàn)，目前已有關于干酪肽對腸道有益菌影響的報道[49]。

明珠等[50]利用個體化基因組測序系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乳源酪蛋白糖巨肽CGMP促進了潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)小鼠腸道菌群的多樣性。其他研究[51]也證實了CGMP可以作為乳源的生物活性肽應用于腸道菌群的調節(jié)劑或促進劑，對腸道有益菌的生理狀態(tài)具有顯著影響。Charlet 等[52]使用嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌制作干酪時，發(fā)現(xiàn)兩者之間有一定的生長互惠關系，但是未指明這種互利關系的關鍵物質。此后程志才等[53]結合流式細胞術研究得出不具有空間構象的QEPV肽能夠很好地被嗜熱鏈球菌所吸收，一定質量濃度的QEPV (0.50 mg/mL)能夠顯著促進嗜熱鏈球菌的生長和發(fā)酵，也因此證實了QEPV肽是嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌互惠關系的橋梁物質之一。Basiricò等[28]研究了Parmigiano Reggiano干酪消化后的肽組分對雙歧桿菌和乳酸桿菌的影響，結果發(fā)現(xiàn)多數肽可被2種菌體特異性地消耗，且雙歧桿菌對肽組分的消耗更加多樣化且消耗量更大，這些肽組分作為氮源能夠有效促進大多數乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長。但Sedaghatia等[40]在研究β-酪蛋白的纖溶酶消化物的抗菌特性時發(fā)現(xiàn)消化物中的肽組分除了對2種致病菌有抑制作用外，2種益生菌(干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌)對抗菌肽也較為敏感，所以多肽對有益菌的增殖具有一定的選擇性，并不是促進所有細菌的生長。因此在食品工業(yè)生產中需要考慮生物活性肽對多種益生菌是促進還是抑制影響。

5 總結及展望

肽是21世紀生物應用的前沿課題，在功能保健食品和特殊醫(yī)藥食品方面具有廣闊的前景。因此含高營養(yǎng)蛋白質的干酪是研究多肽的關鍵點。

干酪生物活性肽經蛋白質的水解而產生，并表現(xiàn)出多種生物活性，其對未來功能性產品的研發(fā)具有重要意義。新序列的干酪多肽不斷被發(fā)現(xiàn)，但是很多研究[21，30，38]并未考慮到小腸吸收的問題，即使通過腸道模擬試驗。人體真實水解環(huán)境以及腸道微生物之間強烈且不可預測的競爭，需要更加深入的研究與討論。

研究者未來可借助多種分析手段分離干酪生物活性肽和追蹤肽在體外消化吸收過程中或人和動物血漿中的變化軌跡，以此增加對特定活性肽的分子機制和藥物動力學性質的科學認識，并將完善對健康的影響機理。