基于硼親和策略的分子印跡技術研究進展

徐 斐 郭 猛 葉 泰 袁 敏 曹 慧 于勁松 袁 然 徐曉喆 史景灝 苑紅恩

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093)

核苷、糖類、多聚糖和糖蛋白等一類含有順式二醇的生物分子在代謝組學、糖組學和蛋白質組學等研究領域具有重要意義。但生物樣品中，含有順式二醇的生物分子含量較低，并且高濃度的干擾組分嚴重影響檢測的靈敏度和準確性。因此，針對具有順式二醇的生物分子的選擇性富集顯得尤為重要。在眾多分離富集方法中，基于與順式二羥基化合物的可逆共價結合作用實現分離富集的硼親和策略引起研究者的廣泛關注[1]。pH值調控的可逆共價結合作用是硼親和策略實現選擇性富集的關鍵，硼酸鹽與順式二醇物質的結合、解離取決于其結合特性。當溶液pH高于硼酸配基的pKa值時，硼酸鹽可以與含有順式二醇的物質形成五元或六元環酯；當溶液pH為酸性時，硼酸—順式二醇復合物自動解離。這種可逆的共價結合作用，賦予硼親和材料廣譜選擇性、pH調控結合與釋放、較快的解吸速度等特性。但是，傳統硼親和材料也存在一些局限性：硼酸配基較高的pKa值，導致只能在堿性條件下才能實現共價結合作用，生物兼容性較差；選擇性較差，由于硼酸配基對順式二醇結構的廣譜性識別，無法滿足對特定目標的選擇性富集；親和力較低，大多數硼基材料Kd值為10-5～10-7，低豐度靶標富集時易受干擾。

分子印跡技術(molecular imprinted technology，MIT)是以特定的分子作為模板，通過與功能單體相互作用形成配合物，經過聚合、洗脫，在聚合物表面或內部形成具有選擇性的識別空腔[2]。分子印跡聚合物空腔的可設計性，特異性識別能力在純化和分離[3]、化學/生物傳感器[4]、抗體的生物識別[5-6]和藥物的識別與釋放[7]等領域受到廣泛關注。根據印跡方式，分子印跡通常分為共價[8]和非共價鍵印跡[9]，其中非共價鍵印跡可以針對模板分子進行功能單體的選擇與設計，但預聚合中的動態平衡會導致聚合過程中形成大量非均一的印跡位點；傳統的共價鍵印跡方法雖然能夠獲得均一的印跡位點，但模板分子不易被去除，吸附位點較少。

因此，將硼親和策略與分子印跡技術相結合，硼親和的可逆共價結合反應有利于模板分子的印跡與去除[10-13]；同時，分子印跡所構筑的選擇性空腔[14]，不僅能提高硼親和材料的選擇性能，利用納米尺寸印跡空腔的限域效應[15-16]，還可以進一步提高硼基材料對含有順式二醇結構分子的親和能力，實現快速、穩定、有選擇性的富集含有順式二醇的生物分子。結合最新的研究，文章總結硼親和分子印跡技術在富集核苷、糖類、多聚糖和糖蛋白等方面的研究進展，并對該技術的發展前景進行展望，旨在拓寬分子印跡技術的應用范圍。

1 硼親和分子印跡技術的應用進展

1.1 核苷酸檢測

核苷酸是DNA和RNA的重要組成部分，為生命體細胞代謝提供了信息，其在血液中的含量也可用于評估氧化應激[17]。由于核苷酸分子量較小，而且能夠用于反應結合的官能團也較少，因此研究出一種能夠高效、特異性富集分離核苷酸的方法顯得尤為重要。

利用制備分子印跡聚合物時所形成的選擇性空腔，可以特異性識別模板核苷酸[18]，Longo等[19]以乙酰乙酸甲酯(MAA)為功能單體，9-乙基腺嘌呤(9-EA)為模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)與N,N-(1,2-亞苯基)二(2-甲基-2-甲基丙酰胺)(PDBMP)分別作為交聯劑與引發劑進行引發聚合，制備了含有腺嘌呤識別位點的分子印跡聚合物(MIP)，制備的MIP雖然具有較好的吸附容量和較高的印跡因子，但達到吸附平衡的時間較長(35 min)，且聚合環境中有毒試劑較多。Nesim等[20]制備了一種丙烯酰胺苯基硼酸分子印跡聚合物，用于選擇性富集核苷酸。以苯硼酸化的丙烯酸為功能單體，過硫酸銨為交聯劑，相應的核糖核苷酸鈉鹽作為模板分子，通過電聚合方式在金電極表面形成核苷酸印跡膜，這種利用電聚合方式制備的印跡膜吸附容量可達76 mg/g，印跡因子為8.6，具有很好的選擇性。同時溶液中的腺嘌呤濃度達到納摩爾水平就可以產生明顯的電信號，表明該方法具有很好的靈敏度，同時聚合環境中有毒試劑較少。

為了進一步提高印跡聚合物的熱穩定性和對核苷的吸附效果，Hu等[21]制備了一種具備高吸附能力的MIPs(硼酸鹽親和核殼結構分子印跡)，以胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷為模板分子，氨基苯硼酸(APBA)改性的MAA為功能單體，二氧化硅為載體，EDGMA為交聯劑制備了印跡聚合物，結果表明MIPs在300 ℃以下具有良好的穩定性，在600 ℃以上完全分解。通過HPLC固相萃取柱分析得出，當使用5%三氟乙酸/乙腈(7∶3，體積比)混合溶液為洗脫液，洗脫液體積為0.4 mL時，洗脫后溶液中模板分子的峰面積最高，相對應的峰面積達1.79×105，1.40×106，表明該條件下的洗脫環境最好。當樣品pH為9時，吸附后通過液相方法分析，核苷峰面積最高為1.57×105，表明該條件下MIPs的吸附效果最好，同時所使用的載體二氧化硅具有特殊的中間結構，具有較大的比表面積，在通過SPE柱時，可以吸附更多的模板分子，吸附效率進一步提高。

1.2 糖類及其衍生物檢測

糖類是一類重要的生物分子，在實際應用中具有重要的作用。大多數糖類只有一種具有不同立體化學性質的官能團(羥基)，使得其對不同糖類的識別極為困難。苯硼酸對于含有順式二羥基的物質具有很好的親和力，能夠快速與糖類物質結合，分子印跡技術可以賦予這個過程以選擇性[22]。Tan等[23]以D-果糖與D-木糖為模板分子，硼酸改性的3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷作為功能單體，利用硼親和表面分子印跡策略制備了一種表面熒光分子印跡傳感器，用于選擇性分離糖類。試驗中利用四乙氧基硅烷(TEOS)在堿性條件下縮合形成的SiO2為載體，結合硼親和分子印跡技術，制備得到了一種雙模板分子印跡聚合物。與以往的果糖—木糖分子印跡聚合物(吸附容量18.7 mg/g)相比，制備出的表面分子印跡聚合物的吸附容量達32 mg/g，由于表面分子印跡聚合物的表面具有更多的吸附位點與印跡空腔，同時在引入3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷后，可以通過熒光的變化更方便地判斷模板分子是否被洗脫下來，為判斷模板分子是否洗脫完全提供了有利條件。

為了進一步提高印跡聚合物對模板分子的選擇性和靈敏度，Bhavana等[24]以果糖為模板分子，先將果糖與三氨基苯硼酸(APBA)預結合，在氟化物存在的情況下，采用電聚合方式使APBA在電極表面自聚得到果糖分子印跡聚合物，相比以往制備的印跡聚合物，這種利用電聚合方式制備得到的印跡聚合物對D-果糖的選擇性提高了25%，由于印跡膜附著在電極表面，提高了對D-果糖的檢測靈敏度。

葡萄糖是生物進行生命活動的能量來源，同時也是糖尿病的檢測目標。多數單糖除了立體結構的差異外并沒有其他結構區別，因此很難將葡萄糖與其他單糖區分開來。Chen等[25]制備了一種光引發的硼酸親和分子印跡生物相容性探針，用于葡萄糖的特異性檢測，以4-乙烯基苯硼酸(VPBA)為功能單體，葡萄糖為模板分子，聚乙二醇為致孔劑，聚乙二醇二丙烯酸酯為交聯劑，Irgacure 184為紫外線引發劑，自聚方式制備了親水性MIP。在紫外引發聚合前將預聚物置于毛細管中，聚合結束后可以得到涂覆有MIP印跡層的毛細管探針。制備得到的MIP具有很好的親水性，MIP與葡萄糖的結合常數比其他簡單苯基硼酸與葡萄糖的結合常數高3個數量級，吸附容量達380 μg/g，GC-MS檢測葡萄糖的檢測限為0.7 μmol/L，遠遠優于以往的檢測器，因此在分析實際樣品時可以充分稀釋，降低復雜基質干擾。制備過程簡單，同時可以準確控制探針表面的印跡層厚度，可以快速檢測生物流體和半固體生物組織中的葡萄糖。Muhammad等[26]制備了一種基于硼親和的微萃取探針，將印跡層印跡涂覆在有拉曼活性銀納米粒子的鍍金探針表面，再將探針插入待檢測的植物組織內，在葡萄糖或果糖與硼酸反應形成環酯后，再對探針表面進行分析。制備得到的探針具有較低的檢測限(1 μg/mL)，檢測時間為20 min，探針表面的MIP對葡萄糖與果糖的印跡因子高達12.9，相互作用強度達6.5×104mol/L，探針在緩沖液中存儲2個月后仍具有較高的穩定性，其信號強度僅降低了14%，該探針可以快速檢測一些藥用植物以及草藥植物組織中的一些功能性物質(含有順式二醇結構)，并不僅僅局限于單糖類化合物。

1.3 糖蛋白分離富集與檢測

蛋白質分子印跡一直以來都是研究的熱點[27]，由于較大的尺寸導致蛋白質難以從高度交聯的聚合物網絡中去除，蛋白質空間結構對環境的敏感性和大量潛在相互作用位點可能影響印跡聚合物的交叉反應性和非特異性吸附[28]。為了克服這些缺陷，研究提出了多種印跡方法，如表面印跡[29]、表位印跡[30]、皮克林乳液聚合[31]、分級印跡[32]等印跡策略。其中表面/表位印跡是一種將印跡結合位點錨定在載體表面的方法，可以改善模板蛋白難以被去除的問題。但蛋白質結構對環境的敏感性、印跡過程中可能出現的交叉反應性及非特異性吸附仍未得到解決。將硼親和策略引入蛋白分子印跡中，能夠在保證蛋白結構的同時有效提高印跡的選擇性。硼酸與糖蛋白的共價結合屬于可逆反應，當溶液pH高于硼酸單體的pKa時，硼酸與糖蛋白形成共價復合物；當溶液pH低于硼酸的pKa值時，復合物自動解離，因此只需挑選合適的硼酸作為功能單體，制備出的分子印跡聚合物可以很好地選擇性分離富集糖蛋白，同時苯硼酸自身的親水性以及生物相容性也是其適用于生物分子印跡的一個重要因素[10,33-34]。

Li等[35]報道了基于硼酸鹽的糖蛋白表面印跡方法，以苯胺、3-氨基苯硼酸(APBA)和丙烯酸連續改性的磁性Fe3O4@Au納米顆粒(NPs)作為芯材料，引入硼酸和可聚合雙鍵，以辣根過氧化物酶(HRP)為模板，通過單體在多功能NPs表面上的自由基誘導接枝共聚制備蛋白印跡薄膜。該條件下制備的分子印跡聚合物具有較高的印跡因子(7.80)，較高的吸附容量(38 mg/g)。MIP在90 min內達到0.3 mg/mL的飽和吸附，而非印跡聚合物則需要220 min。將制備的MIP涂覆在電極表面可用于電化學檢測辣根過氧化物酶(HRP)，在0.01～0.30 mg/mL 的濃度范圍內具有良好的線性關系，該方法的檢出限為0.005 mg/mL。

為了進一步提高印跡聚合物對蛋白質的選擇性，Li等[36]利用光引發硼酸鹽親和分子印跡用于分離富集糖蛋白，將模板蛋白與乙烯基苯硼酸在pH≥8.0的適當致孔劑溶液中混合形成預聚物，將預聚物與交聯劑(PEGDA)和適當的UV引發劑混合，然后通過UV引發的自由基聚合方式，使預聚物快速聚合成聚合物，再使用適當的酸性溶液洗脫模板分子，留下與模板相對應的三維印跡空腔，制備好的印跡聚合物特異選擇性強，印跡因子為9.2。通常基于硼親和的分子印跡需在堿性環境下才能實現對含有順式二醇結構分子的識別，但通過UV引發制備出的MIP可以在pH為6的環境中對模板分子有明顯的親和力，可檢測到模板蛋白的存在，拓寬了MIP的pH范圍，無需對樣品進行預處理。

同時，糖蛋白在多種生命活動中起著至關重要的作用，是疾病診斷和治療靶標的重要生物標志物。但糖蛋白在體內的豐度很低，且干擾物質濃度較高。因此，開發出一種快速、準確識別目標糖蛋白，具有高度靈敏度的方法顯得尤為重要。Sun等[37]將分子印跡技術與硼親和相結合，制備了一種紙基電化學生物傳感器，用于檢測卵清蛋白(OVA)。先對載體二氧化硅進行一系列的修飾得到SiO2@An/dsDNA/CeO2作為電化學檢測時的信號標簽，然后以4-巰基苯硼酸為功能單體制備糖蛋白印跡膜，最后將印跡膜附在電極表面進行電化學分析。制備出的電化學傳感器可以用于檢測1 pg/mL～1 000 ng/mL線性范圍內的OVA，檢測限較低(0.87 pg/mL)，對于臨床診斷以及其他相關領域具有良好的應用前景。Zhu等[38]制備了一種硼親和分子印跡聚合物，以更好的特異性分離富集卵清蛋白。首先通過蒸餾—沉淀聚合法制備四氧化三鐵@甲基丙烯酸縮水甘油酯納米粒子作為分子印跡載體，然后將氨基苯硼酸與乙二胺通過形成的B-N配位絡合物固定在四氧化三鐵@甲基丙烯酸縮水甘油酯納米粒子表面作為功能單體，最后加入模板蛋白，通過自聚合形成印跡層。制備的印跡聚合物不僅可以利用自身硼親和作用吸附/解吸模板蛋白，同時其磁性特征可以在外加磁場時分離，重復利用性較好，制備的印跡聚合物對OVA的吸附容量達230.8 mg/g，印跡因子為7.51，同時印跡聚合物在弱酸至弱堿性溶液中表現出較好的吸附性能，說明制備的印跡聚合物在生理條件下的復雜實際樣品具有很好的應用前景。

1.4 細菌檢測

細菌感染會造成嚴重的健康威脅，因此實現細菌病原體的早期檢測和鑒定顯得尤為重要。目前大多數檢測方法是將抗體和親和肽作為識別原件，但是抗體和親和肽制備成本高、步驟繁多且貯存穩定性較差，同時還需配備精密的檢測儀器和專業的試驗人員。分子印跡聚合物由于制備過程相對簡單，良好的穩定性已被用于細菌的選擇性檢測[39]，且細菌表面存在大量富含順式二醇的物質如磷壁酸、肽聚糖和細菌外壁上的脂多糖，易于通過硼親和策略實現對細菌的識別。Mohsen等[40]以間氨基苯硼酸(3-PBA)為功能單體，葡萄糖球菌為模板細菌，采用電化學聚合的方法在電極表面制備出細菌印跡聚合物(CIP)，采用果糖的競爭性置換去除模板細菌。結果表明，CIP生物傳感器在檢測葡萄糖球菌時，在103～107CFU/mL 的濃度范圍內表現出良好的線性關系。基于CIP的分子印跡傳感器在濃度為10 CFU/mL情況下對檢測模板細菌仍有響應，而NIP基本無響應，說明CIP在制備過程中形成了對模板細菌識別的印跡空腔，同時采用競爭性方法去除模板細菌，不會對細菌活性結構產生影響。

1.5 細胞檢測

癌癥是目前致死率最高的一類疾病，由癌癥導致死亡的90%都是因為癌細胞發生了轉移，因此，在人體血液中對癌細胞進行檢測和隔離對于早期的診斷和治療具有重要意義。用于分離細胞的技術大都基于細胞的物理或化學性質[41]，常規的方法有密度梯度離心[42]、介電電泳[43]，或是基于細胞大小、密度、電荷或遷移性質[44]，這些方法缺乏特異性，而用于特異性檢測某種癌細胞的方法大都依賴于生物識別分子，尤其是抗體，但生物識別分子難以制備以及保存穩定性差(易失活)。癌變時，細胞表面通常會發生糖基化現象，可以利用硼酸對于這種含有順式二醇的糖類化合物具有的親和力將硼親和與分子印跡結合起來，用于分離和檢測癌細胞[45]。Wang等[46]制備了一種單糖熒光分子印跡聚合物用于靶向識別癌細胞，以硼酸修飾的二氧化硅熒光納米粒子為載體，分別以唾液酸、巖藻糖和甘露糖為模板分子，四乙氧基硅烷為交聯劑，利用硼親和分子印跡技術制備了不同模板印跡的二氧化硅熒光納米粒子(MIP)，用于癌細胞的靶向識別與熒光成像，試驗中未加入模板分子制備得到NIP。結果表明，在干擾細胞與癌細胞同時存在的情況下，MIP與癌細胞結合后呈現強熒光，而干擾細胞則無熒光，使用NIP作用兩種細胞時，在熒光成像下均無熒光，這種方法有利于癌細胞檢測，在對MIP與NIP染色后，印跡聚合物同樣可以作為癌細胞成像的工具。相比常規的細胞檢測手段，印跡聚合物易制備，具有良好的保存穩定性，尤其是在引入熒光色素后，為檢測癌細胞的靶向識別與成像提供了有利條件。

將硼親和分子印跡與表面增強拉曼散射技術(SERS)相結合，Yin等[47]以唾液酸(SA)為模板分子，以具有表面增強拉曼效應的銀納米粒子(AgNPs)為載體，通過TEOS(交聯劑)在含有氨水的乙醇溶液中縮聚反應得到表面分子印跡聚合物，用于識別表面含有唾液酸殘基的癌細胞，從而針對正常細胞、癌細胞和組織進行選擇性成像。將SA印跡的銀納米粒子與癌細胞和正常細胞分別作用一段時間后，癌細胞出現很強的SERS信號，而正常細胞基本無信號。基于硼親和分子印跡制備的SERS探針克服了使用傳統抗體探針難于制備、易于降解的缺點，改變SERS探針中的印跡模板可以擴展到其他癌癥標記物的識別與成像。為更靈敏地檢測癌變細胞表面的唾液酸，Shinde等[48]制備了一種熒光核殼結構的分子印跡聚合物，以SA為模板分子，乙烯基苯硼酸為功能單體，EDGNA為交聯劑，硝基苯并惡二唑為熒光標記基團，采用自由基聚合方式制備得到MIP，結果表明，MIP與SA的相互作用強度達6.6×105mol/L，而葡萄糖醛酸及其他單糖與MIP的相互作用強度最高為1.8×105mol/L，在細胞成像試驗中，表面有唾液酸表達形成聚糖的細胞會被染色聚集，而正常細胞沒有這種現象，該方法可應用于低濃度的唾液酸檢測，具有較好的臨床應用價值。

2 硼親和分子印跡技術的發展方向

目前關于核苷酸、細菌、細胞等物質的分子印跡技術雖然已經有了較為長遠的發展，但是由于此類物質本身并未含有較多可以印跡的官能團，因此印跡效果不理想，硼親和策略的引入使得分子印跡技術在方法學上被推向了新的高度，高效、準確、可控的優點，使得硼親和分子印跡成為了研究熱點。藥物分析、疾病診斷、癌細胞的成像與靶向治療等方面的應用，使得硼親和分子印跡技術的發展方向不再局限于某一類化學物質的檢測，同樣可以應用于臨床等方面(抗體的高效、選擇性萃取、酶活性分析等)。

3 總結

基于硼親和分子印跡技術的迅速發展，尤其是對核苷酸、糖、糖蛋白、細胞和細菌識別及富集中具有顯著的優勢。但硼親和分子印跡技術仍存在不足，主要體現在：① 在制備硼親和分子印跡過程中仍需加入氟化鈉、過硫酸銨等有毒有害試劑，試驗大都在有機相中進行，而用于水相印跡的體系較少，同時如何實現印跡層的可控制備和定向印跡仍需進一步研究。② 硼親和分子印跡技術目前僅限于含有順式二醇結構的物質，如何拓展到其他分子或離子印跡中仍有待研究。③ 進一步拓展硼親和分子印跡聚合物在不同光電傳質界面上的應用。