三個國家Cascade酒花香氣對比分析

郭彥偉，聶 聰*，關雪芹，張 潔，楊貴恒

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250030）

啤酒花（Humulus lupulus L.）為蕁麻目大麻科葎草屬植物多年生草質蔓生藤本植物的雌性球穗花序[1-2]。啤酒花主要用于啤酒釀造，其能夠保證啤酒的品質并賦予啤酒獨特的風味，被譽為“啤酒的靈魂”[2-3]。啤酒花主產于歐洲、美國、中國、澳大利亞等地。我國種植地主要集中在新疆、甘肅等地[4]。近年來，精釀啤酒迅猛發展，對啤酒花數量和質量都有了很高的要求。酒花主要成分包括酒花樹脂、酒花油和多酚物質，為啤酒提供香味、苦味[5-6]。啤酒的苦味主要由α-酸的異構化、異α-酸、β-酸的氧化物、酒花多酚等物質形成[5，7-8]。酒花油的成分非常復雜，目前已經成功鑒定出了485種物質，并推測酒花油中約存在1 000種物質[7]。酒花多酚物質是天然的抗氧化劑，參與抗氧化過程[9-10]。不同的酒花添加方式對啤酒風味的影響有著很大差別，在麥汁煮沸開始時添加酒花，能使啤酒體現苦味。在儲酒期添加酒花，可以使啤酒具有清新的鮮酒花風味[7]。

氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）因其具有檢測特定離子碎片的功能，使得對未知化合物的定性更加準確，也因此被廣泛應用于啤酒中酒花香氣物質的定性和定量研究[11]。1978年有學者使用GC-MS鑒定出德國啤酒中超過110種酒花香氣物質[12-13]。然而，由于啤酒基體的復雜性以及酒花香氣物質在啤酒中僅微量存在，對啤酒樣品前處理顯得十分重要，目前最方便和流行的前處理方式是頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）技術[14]，其具有簡便快速、靈敏度高、環境友好等優點[9，15]。其所需樣品量小，同時無需萃取溶劑，大大節省了溶劑消耗，而且氣體樣品能夠直接進行萃取分離，大大提高了氣體樣品的萃取效率。

采用頂空固相微萃取氣相色譜-質譜（HS-SPME-GCMS）聯用的方法[16-17]，對中國、美國和新西蘭Cascade顆粒酒花中香氣化合物的組成進行檢測分析，分別與Cascade酒花在麥汁時添加酒花酒樣的香氣化合物和啤酒儲存期干投后酒樣的香氣化合物進行對比分析，同時分別進行感官品評。既能夠對三個國家的Cascade酒花的香氣化學成分進行檢測對比，又可以對添加該酒花的啤酒進行感官分析對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年份Cascade酒花：分別產自中國新疆地區、美國俄勒岡州產區、新西蘭。均使用鋁箔袋抽真空并冷凍保存于冰箱。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、5975C質譜儀、HP-5（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）：美國Agilent公司[18]；聚二甲基硅氧烷StableFlex固相萃取頭：Sigma-Aldrich公司；DVB-CAR-PDMS型頂空固相微萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）法提取顆粒酒花香氣成分

準確稱取8.0 g酒花顆粒樣品，粉碎后立即置于50 mL頂空樣品瓶中，密封瓶口，將樣品置于恒溫水浴鍋中，50℃預熱5 min。然后連接固相微萃取裝置對酒花香氣成分進行吸附（實驗前先將萃取頭老化5 min），50℃條件下固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，進行解吸。

1.3.2 頂空固相微萃取（HS-SPME）法提取酒樣中的酒花香氣成分

分別取煮沸時添加Cascade酒花和干投Cascade酒花的啤酒樣品20 mL，加入50 mL頂空樣品瓶中，放入磁子，密封瓶口，將樣品瓶放在磁力攪拌加熱器上，攪拌速度為200 r/min，40℃預熱5 min，然后連接固相微萃取裝置對酒花香氣成分進行吸附，40℃固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，進行解吸。

1.3.3 感官品評

將三個國家的Cascade顆粒酒花以及煮沸時添加酒花的酒樣和干投酒花后的酒樣分別進行感官品評。由齊魯工業大學（山東省科學院）中德啤酒技術中心師生和兩位國家級品酒師組成10人（5男5女）品評小組對酒樣進行品評。從柑橘香、水果香、花香、草藥香、香料香五個方面進行品評打分，每個方面為0～5分。

1.3.4 色譜條件

載氣：高純氦氣（He）；進樣口溫度：250℃；載氣流速：1 mL/min；分流比：30∶1；柱室程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以5℃/min速率升至210℃，保持3 min。

質譜檢測器，電子電離（electron ionization，EI）源，質量掃描范圍（m/z）30～400，四級桿溫度150℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，電子倍增器電壓1 400 V[19]。

1.3.5 定性及定量方法

定性方法：化合物在GC-MS上的采集信息通過Masshunter Workstation B.03.01數據處理軟件處理。美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫2.0檢索。

定量方法：通過Agilent自帶的化學工作站數據處理系統，并用氣相色譜峰面積歸一法定量計算出各化學成分在酒花中的峰面積的相對含量[20-21]。

2 結果與分析

2.1 三個不同國家Cascade酒花香氣對比分析

在氣相色譜條件下，可以分離出100多種成分，經計算機檢索譜庫及人工分析質譜圖，并參閱有關文獻，從新西蘭Cascade酒花鑒定出31種物質，美國Cascade酒花鑒定出23種物質，中國Cascade酒花鑒定出17種物質，結果如表1所示。

由表1可知，相比較于新西蘭Cascade酒花，中國Cascade酒花沒有檢測到α-蒎烯、依蘭烯、α-金合歡烯、α-杜松烯、羅勒烯，異丁酸異戊酯、異丁酸-2-甲基丁酯、2-甲基丁酸香葉酯、丁酸香葉酯，芳樟醇、香葉醇，2-十一酮、2-十三酮以及γ-亞麻酸。美國Cascade酒花沒有檢測到異丁酸異丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、2-甲基丁酸香葉酯，羅勒烯、α-杜松烯，2-十三酮及γ-亞麻酸。中國Cascade酒花香味物質沒能完全體現Cascade酒花作為苦香兼優酒花的功效。

表1 三個不同國家的Cascade顆粒酒花香氣成分Table 1 Aroma compounds of granular Cascade hops from three different countries

2.2 三個不同國家酒花在煮沸時添加酒樣酒花香氣對比分析

在氣相色譜條件下，經計算機檢索譜庫及人工分析質譜圖，并參閱有關文獻，在煮沸過程中添加Cascade酒花，新西蘭鑒定出17種香氣物質，美國酒花鑒定出7種香氣物質，中國酒花鑒定出10種香氣物質。結果如表2所示。

由表2可知，在煮沸時添加酒花，酒樣中的香氣物質都比較少。相比較，酒樣中酒花香氣物質含量最豐富的是新西蘭Cascade酒花，香氣物質含量居中的是中國Cascade酒花，香氣物質含量最少的是美國Cascade酒花。相比較于煮沸時添加的新西蘭Cascade酒花，中國Cascade酒花在煮沸時添加檢測到異戊醛和2-甲基丁醛兩種香味物質。異戊醛天然存在于柑桔、檸檬等精油中。高度稀釋時有似蘋果香氣，質量濃度＜10.0 mg/L時呈桃子香味。說明中國Cascade酒花煮沸后會產生新的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味。沒有檢測到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、異戊酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸香葉酯，2-十一酮及氧化石竹烯。美國Cascade酒花只檢測到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯，月桂烯、d-檸烯、石竹烯、葎草烯及芳樟醇。總之，Cascade酒花不適合在煮沸鍋中加入，香氣物質損失很大，可以嘗試其他添加方法，會使酒花利用率提高。

表2 煮沸時添加三個不同國家的Cascade酒花的酒樣香氣成分Table 2 Aroma compounds of beer samples adding Cascade hops from three different countries during boiling

2.3 三個不同國家酒花干投后酒樣香氣物質對比分析

在氣相色譜條件下，經計算機檢索譜庫及人工分析質譜圖，并參閱有關文獻，新西蘭Cascade酒花在儲存期干投后酒樣酒花香氣物質鑒定出27種物質，美國Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質鑒定出23種物質，中國Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質鑒定出20種物質。結果如表3所示。

由表3可知，干投Cascade酒花后，相比較于新西蘭Cascade酒花，美國Cascade酒花檢測到丙醇、2-十一酮、β-瑟林烯三種新西蘭Cascade酒花中沒有的物質。而未檢測到乙酸-2-甲基丁酯、異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸芳樟酯。中國Cascade酒花檢測到丙醇一種新西蘭Cascade酒花中沒有的物質。而未檢測到異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、4-癸烯酸甲酯、丁酸芳樟酯，D-檸烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯、δ-杜松烯烯類物質以及2-十一酮。總之，干投后Cascade酒花的香氣都得到了很好的體現。三個國家的Cascade酒花較適合干投，干投酒花的利用率最高。

表3 三個不同國家的Cascade酒花干投后酒樣中香氣物質Table 3 Aroma compounds of beer samples dry hopping Cascade hops from three different countries

2.4 三個國家的Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評

Cascade顆粒酒花中，新西蘭酒花的柑橘香、水果香和香料香較突出；煮沸過程中添加Cascade酒花，中國酒花的水果香和柑橘香較突出，美國酒花的草藥香較突出；在儲存期干投Cascade酒花，新西蘭酒花的柑橘香、水果香較突出，美國酒花的草藥香和香料香較突出。Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評的香氣雷達圖如圖1所示。

圖1 顆粒酒花香氣（A）、煮沸時添加酒花酒樣香氣（B）、干投酒花酒樣香氣（C）雷達圖Fig.1 Aroma radar map of granular Cascade hops(A)and beer samples adding hops during boiling(B)and dry hopping(C)

由Cascade酒花香氣雷達圖（圖1）可知，Cascade酒花不適合在煮沸時添加，適合干投，干投可以將酒花的香氣物質很好的體現在酒樣中。Cascade酒花及酒樣的感官品評結果與GC-MS檢測的結果基本相符合。

2.5 三個國家的Cascade酒花及酒樣香氣物質數量變化

三個國家的Cascade顆粒酒花香氣物質以及在煮沸時添加酒花酒樣中的酒花香氣物質和在儲存期干投酒花檢測到的酒花香氣物質數量對比如圖2所示。

圖2 Cascade酒花及其酒樣香氣物質種類變化Fig.2 Quantity changes of aroma compounds in Cascade hops and beer samples

與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少17種，增加3種，在啤酒儲存期干投香氣物質減少19種，增加12種；美國Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少18種，增加2種，在啤酒儲存期干投香氣物質減少12種，增加12種；中國Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少12種，增加5種，在啤酒儲存期干投香氣物質減少11種，增加14種。減少的主要是萜烯類物質，增加的主要是醇和酯類物質。Cascade酒花更適合干投，不適合添加到煮沸鍋中。干投可以提高Cascade酒花的利用率。

3 結論

Cascade顆粒酒花香氣化合物主要包括β-蒎烯、月桂烯、D-檸烯、香葉酸甲酯、古巴烯、乙酸香葉酯、石竹烯、蓽澄茄烯、香檸檬烯、β-金合歡烯、葎草烯、杜松烯、瑟林烯等物質。新西蘭Cascade顆粒酒花酒花鑒定出31種物質，美國Cascade酒花鑒定出23種物質，中國Cascade酒花鑒定出17種物質。新西蘭Cascade顆粒酒花的香氣物質最豐富。與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加和在啤酒儲存期干投的香氣物質減少的主要是萜烯類物質，增加的主要是醇和酯類物質。感官品評方面，在麥汁煮沸過程中添加酒花，中國的Cascade酒花具有突出的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味；在啤酒儲存期干投Cascade酒花，生成較多的醇類物質，酒花的利用率較高。

同樣品種不同國家種植的酒花，酒花香氣物質不完全相同，酒花的香氣物質的影響因素很多。可能與年份、地理環境、土壤條件和氣候環境等有關。具體影響酒花香氣物質的因素有待進一步研究。為酒花香氣物質的形成研究提供進一步的理論依據。