羅漢果內(nèi)生菌的分離及α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選

龍楚媚，付 強(qiáng)，王 琪，周巧麗，趙豐麗，2*，宋云飛，楊文國(guó)

（1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006；3.桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西 桂林 541199）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為廣西桂林特產(chǎn)，味甘，性涼，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，富含維生素C（vitamin C，VC）、糖、氨基酸等多種成分，以及蒽醌、黃酮、多糖、甜甙和多酚等活性物質(zhì)[1-2]，具有止咳祛痰、抗氧化、保肝、抗癌、降脂和減肥[3-4]等作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果提取物對(duì)糖尿病動(dòng)物有降血糖作用，可調(diào)節(jié)人體糖代謝[5-7]。α-淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液淀粉酶和胰淀粉酶在腸道中的活性，減緩食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分吸收，降低血糖和血脂水平，可用于糖尿病、高血脂、肥胖的預(yù)防和治療[8-9]。內(nèi)生菌（endophyticbacteria）是棲居于健康植物組織內(nèi)而對(duì)植物不造成任何實(shí)質(zhì)性危害并與植物建立和諧共生關(guān)系的微生物[10]。研究表明植物內(nèi)生菌有可能產(chǎn)生具有降糖活性的代謝產(chǎn)物，可作為降糖活性物質(zhì)篩選的來(lái)源[11]。

目前，羅漢果內(nèi)生菌方面的研究較少，蔣智[12]從羅漢果根部?jī)?nèi)生菌中篩選出了兩株產(chǎn)羅漢果甜甙V的菌株；張昌志等[13]從羅漢果根中篩選出了產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株；范彩琴等[14]從羅漢果果實(shí)內(nèi)生菌中篩選出多株抗氧化活性較高的菌株。由此可見(jiàn)，羅漢果內(nèi)生菌可作為多種活性物質(zhì)篩選的微生物資源，有待開(kāi)發(fā)與利用。

本研究對(duì)羅漢果內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，篩選產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的菌株，并追蹤菌株發(fā)酵產(chǎn)物降糖的有效部位，旨在能夠找出一種可用于治療或緩解糖尿病的新藥物，并為羅漢果內(nèi)生菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮的羅漢果植株和果實(shí)：于2016年10月采自廣西桂林市龍勝縣。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取去皮土豆200 g，切塊，煮沸30 min，8層紗布過(guò)濾，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，定容至1 L，pH值自然，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基，pH值自然，121℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

α-淀粉酶（40 U/mL）：上海藍(lán)季生物科技發(fā)展有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿卡波糖（5 mg/mL）：杭州中美華東制藥有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；HZ200LB型恒溫?fù)u床、HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；UV mini-1240型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控聲波清洗器：昆山市超聲器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內(nèi)生菌分離純化

用自來(lái)水將羅漢果根洗凈、晾干，使用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗一次，次氯酸鈉浸泡13 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次，完成表面滅菌處理。取最后一次洗滌材料的無(wú)菌水涂布于PDA培養(yǎng)基上，作為陰性對(duì)照，將表面滅菌處理后的羅漢果材料剪碎接種到PDA培養(yǎng)基上，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察生長(zhǎng)情況，待材料周?chē)L(zhǎng)出菌落，則進(jìn)行分離純化得到羅漢果內(nèi)生菌，最后將分離出的菌株接種到PDA試管斜面中4℃保藏待用。

1.3.2 α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選

內(nèi)生菌的發(fā)酵：將篩選出的內(nèi)生菌活化后接種到裝液量為200 mL/500 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束后減壓抽濾得到發(fā)酵液，采用打洞法和Bernfeld法進(jìn)行α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選。

打洞法[15]：將2%淀粉溶液與4%瓊脂溶液等體積混勻加熱溶解，精確量取40 mL倒平板，待完全凝固后用直徑為1 cm打孔器呈正三角形狀打孔備用。將發(fā)酵液與1 mg/mL α-淀粉酶液等體積混合，37℃水浴30 min，取0.4 mL注入平板中的孔洞中，37℃恒溫反應(yīng)24 h（蒸餾水作陰性對(duì)照，1 mg/mL阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照）。反應(yīng)完后用稀碘液顯色，顯色后采用直尺測(cè)量平板透明圈大小，根據(jù)平板上透明圈的有無(wú)以及與對(duì)照組透明圈大小的對(duì)比判斷發(fā)酵液中是否含有α-淀粉酶抑制劑以及作用的強(qiáng)弱。

Bernfeld法[16-18]：精確量取0.25 mL樣品與1 mg/mL α-淀粉酶溶液等體積混合，37℃溫浴10 min后加入預(yù)熱至37℃的1.5%可溶性淀粉溶液0.5 mL，37℃溫浴5 min，加入DNS溶液1 mL，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，稀釋10倍后靜置30 min，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定OD540nm值，記為V樣。以蒸餾水代替供試溶液測(cè)定OD540nm值記為Vmax；以蒸餾水代替供試溶液和α-淀粉酶溶液測(cè)定OD540nm值記為Vmin；以蒸餾水代替α-淀粉酶溶液測(cè)定OD540nm值記為V本，計(jì)算樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率R，計(jì)算公式如下：

1.3.3 α-淀粉酶抑制劑活性部位的追蹤[19]

將篩選所得菌株的1 L發(fā)酵液分別減壓抽濾，得到發(fā)酵液和菌絲體。

菌絲體在50℃恒溫烘干后，研磨粉碎，稱(chēng)取10 g樣品，分別采用500 mL的蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液置于50℃超聲波清洗器中浸提30 min，重復(fù)3次，減壓濃縮10倍，分別得到菌絲體水提物和醇提物，采用打洞法檢測(cè)其是否對(duì)α-淀粉酶具有抑制活性，以判斷菌絲體是否具有α-淀粉酶抑制活性。

發(fā)酵液濃縮至500 mL，再依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種有機(jī)溶劑等體積分別萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和萃取后剩余的水相共4種浸膏。稱(chēng)取一定量各相的浸膏，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的待測(cè)液，采用Bernfeld法檢測(cè)發(fā)酵液的各萃取相對(duì)α-淀粉酶的抑制活性。以質(zhì)量濃度為1 mg/mL的阿卡波糖溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)以不加α-淀粉酶溶液作為空白對(duì)照組和以水代替發(fā)酵液作為陰性對(duì)照組。

1.3.4 α-淀粉酶抑制劑活性部位化學(xué)成分分析

將具有α-淀粉酶抑制活性的有效相浸膏制成水懸液，采用顏色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)成分研究。具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[20]。

1.3.5 α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌株初步鑒定

采用點(diǎn)植法將菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察菌株菌落形態(tài)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果內(nèi)生菌分離純化結(jié)果

從羅漢果根中分離純化得到10株內(nèi)生菌，分別編號(hào)為PD-1～PD-10。

2.2 α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌篩選結(jié)果

采用打洞法篩選α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。采用Bernfeld法篩選α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 基于打洞法α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of theα-amylase inhibitors-producing strain by hole drilling method

表1 α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌篩選結(jié)果Table 1 Screening results of theα-amylase inhibitors-producing strain

由圖1和表1可知，分離的10株菌株中，菌株P(guān)D-3和PD-4的透明圈直徑分別為2.12 cm和1.19 cm，較阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照（2.2 cm）?。粚?duì)α-淀粉酶的抑制率分別為42.51%和56.29%，與阿卡波糖（46.44%）相比，具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性。兩種方法的測(cè)定結(jié)果相同，說(shuō)明它們都對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制活性；而其他菌株的透明圈直徑與陰性對(duì)照一樣，且α-淀粉酶抑制率極低或無(wú)，說(shuō)明它們均無(wú)α-淀粉酶抑制活性。因此，選取菌株P(guān)D-3和PD-4進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.3 α-淀粉酶抑制劑活性部位的追蹤

2.3.1 菌株菌絲體提取物α-淀粉酶抑制活性測(cè)定結(jié)果

以水代替發(fā)酵液作為陰性對(duì)照組，采用打洞法測(cè)定菌株P(guān)D-3與PD-4的菌絲體水提物與醇提物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性，結(jié)果表明，菌株P(guān)D-3水提物與醇提物的透明圈直徑分別為（3.19±0.01）cm、（3.21±0.005）cm；菌株P(guān)D-4水提物與醇提物的透明圈直徑分別為（3.18±0.02）cm、（3.19±0.01）cm；與陰性對(duì)照（3.18±0.01）cm相比，菌株P(guān)D-3與PD-4的菌絲體水提物與醇提物均對(duì)α-淀粉酶無(wú)抑制活性。

2.3.2 菌株發(fā)酵液α-淀粉酶抑制活性測(cè)定結(jié)果

采用Bernfeld法測(cè)定菌株P(guān)D-3與PD-4的發(fā)酵液各萃取相對(duì)α-淀粉酶的抑制活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株P(guān)D-3與PD-4發(fā)酵液α-淀粉酶的抑制結(jié)果Fig.2 Inhibiting results of fermentation broth of strain PD-3 and PD-4 onα-amylase

由圖2可知，當(dāng)供試液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖（45.17%）相比，菌株P(guān)D-3抑制α-淀粉酶的有效相為正丁醇相，其α-淀粉酶抑制活性最高，為74.19%，其次為乙酸乙酯相（51.61%），其他相活性低；菌株P(guān)D-4抑制α-淀粉酶的有效相為乙酸乙酯相，其α-淀粉酶抑制活性最高，為88.46%，其次為正丁醇相（48.52%），其他相活性低。結(jié)果表明，兩株菌發(fā)酵液經(jīng)萃取后活性成分得到初步純化和富集，最終獲得菌株P(guān)D-3、PD-4發(fā)酵液對(duì)α-淀粉酶抑制活性較高的有效相分別為正丁醇相和乙酸乙酯相。

2.4 α-淀粉酶抑制劑活性部位化學(xué)成分分析結(jié)果

表2 有效相中α-淀粉酶抑制劑活性化學(xué)成分分析結(jié)果Table 2 Analysis results of active chemical composition of α-amylase inhibitors in effective phases

續(xù)表

由表2可知，初步判斷菌株P(guān)D-3的有效相正丁醇相中主要含有多糖、黃酮等化學(xué)成分，菌株P(guān)D-4的有效相乙酸乙酯相中主要含有還原糖、黃酮、酚和醌等化學(xué)成分。

2.5 菌株形態(tài)觀察結(jié)果

菌株P(guān)D-3與PD-4形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株P(guān)D-3與PD-4的菌落及菌絲形態(tài)Fig.3 Colonies and mycelium morphology of strain PD-3 and PD-4

由圖3可知，菌株P(guān)D-3菌落表面為灰綠色，邊緣白色，背面微黃色，菌絲頂部有多細(xì)胞的分生孢子梗，孢子串生呈卵圓形。菌株P(guān)D-4菌落正面灰綠色，呈環(huán)狀往外生長(zhǎng)，背面黃色，菌絲體無(wú)隔，菌絲頂部有多細(xì)胞的分生孢子梗，孢子卵圓形。初步鑒定菌株P(guān)D-3與PD-4均為青霉屬（Penicillium）。

3 結(jié)論

從羅漢果根中分離純化得到10株內(nèi)生菌，采用打孔法和Bernfeld法從中篩選出2株產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的菌株P(guān)D-3和PD-4，兩菌株發(fā)酵液對(duì)α-淀粉酶的抑制率分別為42.51%和56.29%；具有α-淀粉酶抑制活性的均為發(fā)酵液，菌絲體沒(méi)有α-淀粉酶抑制活性；發(fā)酵液經(jīng)有機(jī)溶劑萃取、初步純化后，當(dāng)供試液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，菌株P(guān)D-3的正丁醇相對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高，為74.19%，而菌株P(guān)D-4的乙酸乙酯相對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高，為88.46%，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取可對(duì)菌株產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)初步的純化和富集，較1 mg/mL阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制率（45.17%）高，表明羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制活性；有效相化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，菌株P(guān)D-3的有效相正丁醇相主要含有多糖、黃酮等化學(xué)成分，菌株P(guān)D-4的乙酸乙酯相主要含有還原糖、黃酮、酚和醌等化學(xué)成分，具體哪種化學(xué)成分起到降糖作用有待于進(jìn)一步的研究。兩菌株經(jīng)形態(tài)觀察均初步鑒定為青霉屬（Penicillium）。