超聲聯(lián)合酶法提取玫瑰花總黃酮工藝條件優(yōu)化

何效平，王柏強(qiáng)，曾芝蘭，羅飛，羅巧林

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，四川 南充 637000

玫瑰花為薔薇科薔薇屬多年生灌木玫瑰的干燥花蕾，是一種藥食同源的花卉，具有良好的食用價(jià)值與保健功能。玫瑰花中含有多種生物活性物質(zhì)，黃酮類化合物就是其中之一。黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、降糖、抗病毒、抗抑郁等生物活性。國內(nèi)對玫瑰花總黃酮的提取進(jìn)行了大量研究，常見提取方法主要有水提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法等[1-4]。但國內(nèi)采用超聲波聯(lián)合纖維素酶提取玫瑰花總黃酮的研究尚未見報(bào)道，本文以總黃酮提取率作為評價(jià)指標(biāo)，采用超聲波聯(lián)合纖維素酶提取玫瑰花總黃酮，在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)玫瑰深加工產(chǎn)品提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

760CRT雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；PHS-SB型pH計(jì)(成都瑞馳分析控制儀器有限公司)；TP-114電子分析天平(德國賽多利斯股份有限公司)；SB-25-12DT型超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

玫瑰花由重慶源邦醫(yī)藥公司提供，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李生茂老師鑒定為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾。

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：0080-200707)；纖維素酶(活性單位≥15 U·mg-1，上海伯奧生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材前處理

將玫瑰花篩選去除雜質(zhì)后剪碎，置于烘箱中40 ℃下干燥至恒重，粉碎后過20目篩，備用。

2.2 玫瑰花總黃酮的測定方法

2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 將蘆丁對照品于105 ℃下干燥至恒重，精密稱取20 mg，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色量瓶中，60%乙醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，按順序依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；10%氫氧化鈉溶液10 mL，60%乙醇定容至刻度，靜置15 min。同法配制空白溶液[5-8]。用紫外-可見分光光度計(jì)在400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，最大吸收波長為510 nm。見圖1。

圖1 蘆丁對照品顯色后掃描圖

2.2.3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察[8]：精密量取上述蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，轉(zhuǎn)移至6支25 mL量瓶中，按2.2.2項(xiàng)下顯色方法依法操作。用添加0.0 mL對照品溶液的試管做空白對照，在510 nm波長處測定不同濃度溶液的吸光度，對不同蘆丁質(zhì)量濃度和對應(yīng)吸光度作圖，線性回歸得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2.838 4X-0.026 1，r=0.999 8，蘆丁濃度在0.2～2.4 mg線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，在510 nm波長處重復(fù)測定6次，吸光度值的RSD值為0.6%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取藥材提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，于靜置15 min后0、1、2、4、6、8 h依法測定，結(jié)果吸光度值的RSD值為1.2%。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取藥材提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，同法操作6份。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法顯色后依法測定，結(jié)果顯示吸光度值的RSD值為0.9%。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取適量藥材提取液置于25 mL量瓶中，分別加入對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1)5.0、2.0、0.5 mL，然后采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定吸光度值，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%，RSD=1.5%。

2.2.4 樣品總黃酮含量測定 精密吸取待測玫瑰花總黃酮粗提液1 mL置于25 mL容量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，在510 nm波長處測得粗提液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出粗提液中總黃酮的質(zhì)量濃度。然后，按照公式(1)計(jì)算玫瑰花中總黃酮的提取率。

(1)

2.3 單因素考察

2.3.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按固液比1∶20的比例加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后分別加占玫瑰花質(zhì)量0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在40 ℃恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。待酶解完成后再置于超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min，抽濾，濾液定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖2。

圖2 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玫瑰花總黃酮提取的影響

由圖可知，隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)纖維素酶用量占玫瑰花質(zhì)量的0.4%時，酶解反應(yīng)效率和總黃酮提取率最高；超過0.4%后總黃酮提取量反而有所下降，故適宜的纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.5%。

2.3.2 酶解溫度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，分別在20、30、40、50、60 ℃恒溫水浴鍋中酶解90 min，每30 min攪拌一次。酶解完成后再置于超聲波提取器60 ℃超聲提取30 min，抽濾，濾液定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對紫蘇葉總黃酮提取效果的影響

由圖可知，在20～50 ℃，隨著酶解溫度的提高，玫瑰花總黃酮提取率逐漸增加，達(dá)到50 ℃后繼續(xù)升高溫度，總黃酮提取率反而呈下降趨勢。適宜的溫度有利于保持酶的活性，溫度過高易導(dǎo)致酶變性失活。因此，酶解溫度在40～60 ℃為宜。

2.3.3 固液比對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的固液比加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。酶解完成后再于超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min，抽濾，濾液定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖4。

由圖可知，隨著提取溶劑用量的增加，玫瑰花總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)固液比達(dá)到1∶20后再增加料液比，提取率增加不明顯。考慮到經(jīng)濟(jì)性及后處理過程，選擇固液比為1∶15～1∶25較為合理。

圖4 固液比對玫瑰花總黃酮提取效果的影響

2.3.4 乙醇濃度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按1∶20的固液比分別加入到30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。酶解完成后再超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min，抽濾，濾液定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇濃度對玫瑰花總黃酮提取效果的影響

由圖可知，隨著乙醇濃度的增大玫瑰花黃酮提取率逐漸增大，乙醇濃度為30%～60%時增加速率較快，70%以后醇溶性雜質(zhì)溶出明顯增多，同時抑制纖維素酶的活性，導(dǎo)致總黃酮提取率反而有所下降。故選擇乙醇濃度60%為宜。

2.3.5 超聲提取時間對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。待酶解完成后再于60 ℃分別超聲提取10、20、30、40、50 min，抽濾，得到濾液，定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖6。

圖6 超聲時間對玫瑰花總黃酮提取效果的影響

由圖可知，當(dāng)超聲時間在10～30 min時，隨著時間的延長，玫瑰花總黃酮提取率逐漸增加，超過30 min后增加效果不明顯，同時雜質(zhì)溶出量也逐漸增大。因此超聲時間控制在20～40 min為宜。

2.3.6 超聲溫度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。待酶解完成后再分別于40、50、60、70、80 ℃超聲提取30 min，抽濾，得到濾液，定容，取樣測總黃酮含量，然后計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見圖7。

圖7 超聲溫度對紫蘇葉總黃酮提取效果的影響

由圖可知，隨著超聲溫度的提高，玫瑰花總黃酮提取率逐漸上升，到60 ℃后再升高溫度，總黃酮提取率變化緩慢，70 ℃后由于溫度過高，雜質(zhì)溶出量也逐漸增大，導(dǎo)致后續(xù)處理困難。因此，超聲提取溫度選擇在60 ℃比較合適。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)以上單因素考察結(jié)果，選取影響因素較大的固液比、酶解溫度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間4個因素作為考察因素，以總黃酮提取率為評價(jià)指標(biāo)，選擇L9(34)正交試驗(yàn)表(見表1)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析(見表2)和方差分析(見表3)。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2直觀分析可知，各因素對超聲聯(lián)合纖維素酶法提取玫瑰花總黃酮的影響依次為固液比>酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)>超聲時間>酶解溫度；方差分析結(jié)果表明，固液比、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間對提取工藝差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，酶解溫度對提取工藝差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A3B2C2D2，即固液比1∶25，酶解溫度50 ℃，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，超聲時間30 min。按優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)：稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末，按1∶25的固液比加入到60%乙醇溶液中，浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為5，在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min，30 min攪拌一次。待酶解完成后再于60 ℃超聲提取30 min，抽濾，得到濾液，定容，測定指標(biāo)。結(jié)果總黃酮提取率平均值為(4.06±0.93)%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可行。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在充分研究各因素對總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對玫瑰花總黃酮提取的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得了較好的效果，使總黃酮提取率達(dá)到4.06%，是一種較高效的提取方法。

超聲聯(lián)合酶法可從多方面促進(jìn)藥材有效成分的提取，首先運(yùn)用纖維素酶破壞細(xì)胞壁中的纖維素，以加快有效成分的釋放。其次，利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度，增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥有效成分[9]。該法提取條件溫和，提取中所采用的酶安全、價(jià)廉，同時還可減少有機(jī)溶劑的使用量，所以本工藝比傳統(tǒng)提取工藝更加經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。