氫對氧化應激誘導的視網膜衰老的保護機制

李睿嬋，劉 華，李麗華

?KEYWORDS:hydrogen; oxidative stress injury; DNA damage

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)又稱為老年性黃斑變性，是老年人的首要致盲疾病[1]。由于ARMD會導致患者中心視力喪失，其致盲率高，因此患者的生活質量極度下降。隨著全球人口老齡化日益突出，ARMD的患病率也不斷上升。為此，探討該疾病病理機制以及尋找新的治療方法迫在眉睫。而導致ARMD的病因較多，發病機制復雜且爭議較多，盡管國內外對ARMD的發病機制進行了大量的基礎和臨床研究，但其發病機制仍不清楚，目前尚缺乏理想的治療方法和藥物。研究表明，碘酸鈉(sodium iodate，NaIO3)鼠尾靜脈注射可使視網膜發生氧化應激反應，從而導致細胞重要的蛋白和DNA受到破壞[2]，是目前模擬ARMD較為理想的動物模型。氧化應激是造成ARMD的主要原因之一[3]，又有研究表明視網膜衰老也是ARMD發病的重要因素[4]，并且氧化應激通過損傷DNA使維持細胞基本生理功能的基因表達失活，從而導致細胞衰老[5]。我們之前的研究初步證實，氫(hydrogen，H2)通過減少Sirt3蛋白表達的下調并抑制衰老對氧化應激誘導的視網膜損傷起保護作用[6]。由于在衰老發生過程中，伴隨活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導的氧化線粒體DNA損傷產生[7]，并且還有相關研究表明DNA損傷常常伴有氧化應激的產生[8]。因此，本實驗通過研究氫對氧化應激誘導的視網膜損傷保護作用的機制，探討通過降低DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)以延緩視網膜衰老對視網膜氧化應激損傷的保護作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和分組取6～8周齡C57BL/6J正常雄性小鼠30只，體質量18～24g(購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司)。小鼠飼養于SPF級，21℃ 12h光照，12h黑暗。動物管理符合動物保護條例并符合動物倫理委員會要求。實驗前通過裂隙燈檢查排除眼前節疾病，按隨機數字表法將小鼠隨機分為三組：對照組、模型組(NaIO3處理組)和治療組(H2水灌胃組)，每組10只。

1.1.2試劑和儀器酶標儀、凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；恒溫水浴鍋(上海榮計達實驗儀器公司)；ECL發光成像系統(美國Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(美國Sigma公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。NaIO3粉末(北京索萊寶公司)，戊巴比妥鈉粉末(美國Sigma公司)；H2水(北京活力氫源飲品有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；兔抗小鼠ATM單克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗小鼠NF-κB單克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗小鼠細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)單克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗小鼠HMGB1單克隆抗體(英國Abcam公司)，以及小鼠抗小鼠GAPDH單克隆抗體(Proteintech公司)。HRP標記山羊抗兔IgG二抗(Proteintech公司)、HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗(Proteintech公司)；ECL顯影液(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1建立視網膜氧化應激損傷模型用9g/L生理鹽水溶解NaIO3粉末，濃度為2mg/mL，4℃保存。模型組小鼠生理鹽水灌胃7d后造模，按20mg/kg劑量鼠尾靜脈注射NaIO3，再行生理鹽水灌胃5d；對照組小鼠注射相同劑量的9g/L生理鹽水12d。治療組NaIO3注射前小鼠予富含H2的飲用水灌胃(6mL/d)預防性治療7d，然后與模型組一同鼠尾靜脈注射NaIO3，注射后繼續灌胃治療5d。

1.2.2HE染色每組隨機取3只小鼠，石蠟切片，常規HE染色，具體步驟同本課題組之前的研究[6]。

1.2.3SA-β-gal染色檢測氫對小鼠視網膜衰老的影響衰老的細胞會表達一種特異性的衰老相關的β-半乳糖苷酶。這種酶特異性存在于衰老的細胞中，檢測衰老相關的SA-β-gal的活性變化即成為檢測衰老的重要指標[9]。每組隨機取3只小鼠的右眼，40g/L多聚甲醛固定過夜，300g/L蔗糖脫水，OCT包埋后切片，切片厚8μm，將其固定在載玻片上，在5mL/L戊二醛/PBS(pH=6.0)中室溫固定15min，固定后將視網膜在PBS(pH=6.0)中洗滌2次，在SA-β-gal染色溶液中浸泡37℃孵育過夜，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.4Western-blot檢測簡言之，每組剩余的4只小鼠，分別摘取小鼠雙眼視網膜，視網膜組織蛋白提取物(15～20μg)通過二烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離并轉移至PVDF膜上，1% BSA封閉2h，一抗與TBS按照1∶1000的比例稀釋，4℃搖床孵育過夜。TBST洗3次，每次6min，二抗與TBS按照1∶2000的比例稀釋，室溫下搖床孵育2h。ECL顯色，暗室曝光，通過凝膠成像系統記錄圖像。每個實驗至少重復3次，Image J 4.0軟件進行蛋白質半定量分析。

2結果

2.1氫對NaIO3誘導的視網膜損傷的影響HE染色結果見圖1，NaIO3可引起視網膜變薄。它不僅降低了視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)與感光細胞之間的黏附力，而且還使RPE層不連續。并且在RPE周圍出現點狀和大小不均勻的大量黑色沉積物。此外，光感受器內節段(inner segment，IS)和外節段(outer segment，OS)幾乎無法識別。外核層(outer nuclear layer，ONL)中的細胞數量下降，該層的線性結構消失并且有半玫瑰花結構和內陷的形成，在用H2治療的小鼠中防止了這種損失。同樣，NaIO3小鼠內核層(inner nuclear layer，INL)中的細胞密度降低。我們發現H2不僅可以減少布魯赫膜中NaIO3誘導的黑色沉積物的數量和大小，還可以減少視網膜變薄。此外，H2防止了ONL和INL細胞密度的降低和無序排列。

2.2氫對小鼠視網膜衰老的影響SA-β-gal染色結果見圖2，在光學顯微鏡下觀察，衰老形態的細胞SA-β-gal染色呈藍綠色。對照組著染陰性，僅有個別著染藍綠色的細胞；模型組SA-β-gal著染藍綠色的細胞較對照組顯著增加，表明伴隨NaIO3誘導的氧化應激的增加，視網膜細胞的衰老也增多；而治療組SA-β-gal著染藍綠色的細胞與模型組相比顯著減少。由此推斷，H2可以抑制視網膜衰老，對視網膜細胞起保護作用。

2.3氫對氧化應激誘導的視網膜中DNA損傷反應相關蛋白表達的影響Western-blot檢測結果顯示(圖3)，模型組中DNA損傷反應相關蛋白的相對表達量(ATM 0.77±0.08，NF-κB 0.70±0.02，Cyclin D1 0.36±0.01)較對照組(ATM 0.17±0.012，NF-κB 0.27±0.02，Cyclin D1 0.07±0.002)顯著升高，差異均有統計學意義(均P<0.01)，說明氧化應激的產生誘導了DNA損傷。而治療組中DNA損傷反應相關蛋白的相對表達量(ATM 0.10±0.009，NF-κB 0.32±0.01，Cyclin D1 0.19±0.002)較模型組顯著降低，差異均有統計學意義(t=708.7、142.6、105.3，均P<0.01)，表明H2能夠降低氧化應激誘導的視網膜DNA損傷。

圖1小鼠視網膜HE染色A：對照組；B：模型組；C：治療組(圖中黃色箭頭指示為黑色玻璃膜疣沉積物)。

圖2小鼠視網膜SA-β-gal染色A：對照組；B：模型組；C：治療組。

圖3氫對氧化應激誘導的視網膜中DNA損傷反應相關蛋白表達的影響A：DNA損傷反應相關蛋白表達水平；B：各組ATM、NF-κB、Cyclin D1蛋白相對表達量比較。aP<0.05，bP<0.01vs治療組。

圖4氫對氧化應激誘導的視網膜中DNA損傷修復相關蛋白表達的影響A：DNA修復蛋白HMGB1表達水平；B：各組HMGB1蛋白相對表達量比較。bP<0.01vs模型組。

2.4氫對氧化應激誘導的視網膜中DNA損傷修復相關蛋白表達的影響Western-blot檢測結果顯示(圖4)，三組HMGB1蛋白的相對表達量比較，差異有統計學意義(F=82.66，P<0.01)。且模型組中HMGB1蛋白的相對表達量(0.383±0.07)較對照組(1.232±0.03)明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；而治療組中HMGB1蛋白的相對表達量(0.927±0.06)較模型組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。說明氫可以促進視網膜DNA損傷修復。

3討論

ARMD是黃斑區的退行性病變，可使中心視力進行性、不可逆性喪失，嚴重威脅著老年人的視力，是發達國家中老年人視力不可逆下降的主要原因[10]。近年來，我國社會人口老齡化不斷加劇，ARMD 的發病率有逐年增高的趨勢[11]。隨著我國人民生活水平的提高，人均壽命的延長，人們對生活質量越來越重視，影響人視覺健康的眼病日益受到全社會的關注。盡管黃斑變性是多因素導致的眼底部疾病，但據報道，年齡是ARMD最主要的危險因素，高齡ARMD患者的死亡率增加[12]。視網膜衰老是ARMD發病的重要因素，因此，如能減緩視網膜的衰老就可以從源頭上減少ARMD發病率，并減慢其病程進展[13]。而細胞的氧化損傷在衰老過程中起著重要作用[14]。氧化應激是衰老的促進因素[15]。在衰老和衰老相關疾病中可以發現過多的ROS及其他氧化應激產物[5]，因此降低ROS水平已成為鑒定是否有效抗衰老的一個標準[16]。由于目前沒有藥物可以完全模擬臨床ARMD疾病，NaIO3是一種穩定的氧化劑，誘導的視網膜損傷目前被認為是ARMD研究的理想動物模型。本實驗延用我們之前的實驗動物模型[6]，通過HE染色發現NaIO3造模后，可使視網膜變薄，降低了RPE層與感光細胞之間的黏附力并且使RPE層不連續；在布魯赫膜中出現點狀和大小不均勻的大量黑色沉積物。此外， INL層和ONL層細胞數量下降，線性結構消失。且我們之前的研究已經表明，氫能夠減少氧化應激誘導的視網膜衰老相關蛋白P53、P21和P16蛋白表達[6]。本研究中利用衰老特異性SA-β-gal染色，可見給予H2后顯著減少了視網膜中藍綠色沉淀，這進一步驗證了我們之前的研究。

由于高能量需求及光暴露，視網膜對氧化應激高度敏感[3]，過量的ROS可以損害視網膜脂質、蛋白質和DNA，隨后導致視網膜細胞死亡[2]。衰老可以由DNA損傷有關的各種刺激引發[17]，并且DDR的激活證明發生了細胞衰老[18]。DNA損傷會激活ATM[19]，本實驗結果顯示，治療組ATM的表達量明顯低于模型組。還有研究表明，Cyclin D1過表達增強了DDR，相反Cyclin D1減少則降低了DDR，并且Cyclin D1蛋白表達升高會伴隨P21蛋白的上調，進而促進了DDR[20]，所以我們進一步檢測了Cyclin D1的表達，結果顯示治療組中Cyclin D1表達量較模型組明顯降低。此外，DDR下游的參與者中有NF-κB，其可以被DNA損傷激活，反過來NF-κB活化又會導致DNA損傷增加[21]，數據顯示ATM也可以激活NF-κB[22-23]，故我們還檢測了NF-κB的表達，發現治療組中NF-κB表達量較模型組明顯降低。最后，有報道稱高遷移率族蛋白HMGB1有DNA修復功能[24]，可以挽救DNA損傷，延長壽命[25]，所以本研究進一步探討其是否也有這種作用，結果顯示治療組中HMGB1表達量較模型組顯著上調。綜上說明氫通過降低DDR、促進DNA的修復，進而對視網膜氧化應激損傷起保護作用。保護線粒體DNA免受氧化應激損傷將是延緩ARMD進展的一種新策略[26]。

我們的研究為治療ARMD提供了新思路，但對ARMD病理機制和治療還需繼續深入開展，進一步探索ARMD發病機制，并開發ARMD治療藥物仍是研究工作者關注的熱點。