N6-甲基腺苷甲基化及其與腫瘤關系的研究進展

胡威，祝恒成

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

甲基化是甲基(-CH3)添加到一個分子上，并在核酸上觀察到甲基化基團。DNA、RNA和多種蛋白質，包括組蛋白均可甲基化。DNA甲基化主要是在啟動子區域，而組蛋白甲基化對生物體的影響主要取決于甲基化水平和甲基化殘基在組蛋白上的位置[1]。除了DNA和組蛋白的甲基化，另一個水平的表觀遺傳調控已成為近幾年來生命科學領域的研究熱點，即RNA甲基化。RNA甲基化是真核細胞表觀遺傳的關鍵過程，決定其組蛋白結構和基因表達[1,2]。RNA甲基化是RNA修飾中最重要的一種，目前已探明的RNA修飾超過100種。RNA甲基化可存在于多種RNA分子中，如mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反義RNA、核酶和非編碼RNA等，但主要存在于mRNA中，mRNA甲基化主要用于維持mRNA的穩定性[2，3]。RNA甲基化修飾在mRNA處理(剪接、多聚腺苷酸化等)、定位、小RNA處理、tRNA穩定和翻譯抑制或激活中均起重要調節作用。這些規則對組織發育、晝夜節律、DNA損傷反應、性別選擇及包括腫瘤在內的多種疾病發生發展均有較大影響。mRNA最常見的內部修飾包括N6-甲基腺苷(m6A)甲基化、5-胞嘧啶(m5C)甲基化等。m6A甲基化是一種動態、可逆的修飾，其涉及真核細胞的多種生理過程，如mRNA及miRNA加工、mRNA定位、翻譯抑制或激活。m6A甲基化影響機體多種重要的生物過程，如組織發育、性別選擇和DNA損傷反應等[1～3]，現將m6A甲基化及其與腫瘤關系的研究進展綜述如下。

1 m6A甲基化

modomics數據庫是一個基于網絡的數據庫，包含與RNA修飾途徑相關的信息。迄今為止，已有171個RNA修飾被描述，其中包括72個甲基化修飾[4]。mRNA最常見的內部修飾包括m6A甲基化、m5C甲基化等。m5C甲基化是將甲基添加到胞嘧啶核苷酸的第5位碳(C)原子，m6A甲基化即將甲基添加至碳環腺苷酸的第6位氮(N)原子[5，6]。

m6A甲基化最初在20世紀70年代被確定，是最豐富的轉錄后修飾，占總RNA修飾的50%以上。由于受技術條件限制，其早期研究較困難。隨著高通量測序技術的快速發展及表觀遺傳學研究領域的逐步深入，m6A甲基化在不同生物學過程中的功能和作用再次受到關注。近年來，高等真核生物特別是mRNA分子的主要內部修飾越來越引起重視。通過m6A甲基化對蛋白質結合的影響，將影響mRNA分子剪接、定位、多腺苷酸化、翻譯、衰變的每一步。

m6A甲基化有別于其他mRNA內部修飾(如m5C)，其在不改變堿基序列的情況下對基因轉錄后表達水平進行調控，通過影響mRNA與讀取蛋白的結合，從而調控mRNA的剪接、翻譯和穩定。m6A甲基化過程可逆，可精確調控，這一獨特過程是通過以下途徑實現的。①甲基化，加入甲基轉移酶的酶(讀取蛋白，Writer)；②去甲基化，即去除甲基，通過去甲基酶(擦除蛋白)將甲基從碳環上剝離；③識別發生甲基化修飾的RNA堿基位點，并綁定它們，執行特定的生物功能(結合蛋白)[7,8]。目前已發現的讀取蛋白主要有甲基轉移酶-Like家族METTL3、METTL4、METTL14、WTAP(Wilms腫瘤結合蛋白)和KIAA1429、RBM15、CBLL1、2C3H13等[7～9]。已發現的擦除蛋白僅有脂肪質量和肥胖相關蛋白(FTO)、ALKB家族同系物5(ALKBH5)[10,11]。結合蛋白主要有YTH家族的蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1等[12,13]。

如上所述，完成m6A甲基化過程，需讀取蛋白、擦除蛋白、結合蛋白共同參與。這三種蛋白并不是單一的蛋白，而是三種大蛋白質復合物合并在一起，再組成一個超大的蛋白質復合物。讀取蛋白蛋白質復合物負責在腺苷殘基芳環第6個碳上向甲基中加入甲基，該復合物含有由METTL3、METTL4和METTL14蛋白組成的核心結構，具有甲基轉移酶活性[14]。另一種蛋白，Wilms腫瘤相關蛋白(WTAP)亦包括在該復合物中。其與METTL3、METTL4、METTL14相互作用，是定位于富含前mRNA加工因子的核斑點和體內m6A甲基轉移酶的催化活性所必需。除了METTL3、METTL14和WTAP、RBM15、KIAA1429等蛋白外，ZC3H13和CBLL1亦存在于m6A甲基轉移酶復合物中。盡管很早就鑒定了m6A甲基轉移酶復合物(讀取蛋白)的組分，但直至2010年才在高等真核細胞中鑒定出m6A去甲基化酶(擦除蛋白)，并發現FTO和ALKBH5為哺乳動物僅有的兩種去甲基化酶(擦除蛋白)[10,11]。在體外和體內均可通過氧化逆轉mRNA中的m6A甲基化過程。這一發現表明m6A修飾是可逆的，并且是動態調節的。m6A可通過調節多種RNA相關細胞途徑來影響基因表達，并決定RNA在細胞中的命運，能使細胞對各種環境信號產生快速反應，包括哺乳動物的能量來源[14,15]。

一旦m6A甲基化修飾過程啟動，部分細胞質和細胞核蛋白(結合蛋白)將識別修飾位點并綁定到RNA上以執行其特定的功能。目前已被鑒定的主要結合蛋白是含YT521-B同源(YTH家族)結構域的蛋白質,包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3等[14，16]。綁定不同YTH結構域家族蛋白將對m6A位點的不同亞群產生不同影響,并導致其對基因表達產生不同影響。如YTHDF2的結合導致結合的mRNA定位于mRNA衰變位點,導致m6A修飾的mRNA穩定性降低和轉換增加,另一方面，YTHDF1與修飾的mRNA結合并通過與翻譯啟動因子eIF3相互作用,而促進蛋白質合成。YTHDF3則能與YTHDF1、YTHDF2協同作用，當與YTHDF1、YTHDF2結合時，其分別加速mRNA的衰變和翻譯啟動過程[14]。

除了調節mRNA的功能外，m6A甲基化亦參與了前體miRNA(pri-miRNA)的加工。研究發現，m6A識別酶(HNRNPA2B1)將mRNA微處理器復合蛋白募集到經m6A甲基化修飾的RNA位點，并將原代pri-miRNA加工成成熟的miRNA。生物物理學研究表明，m6A修飾亦可對RNA結構產生直接影響。未修飾的腺苷殘基可與RNA結構中的相鄰堿基形成鍵。但當用m6A甲基化修飾殘基時，這使RNA雙鏈體結構(發卡狀RNA)不穩定，將導致與m6A位點相鄰的堿基傾向于斷裂形成單鏈。反之，通過控制m6A甲基化進程可間接控制發卡狀RNA的穩定性，這種現象稱為“m6A開關”[15,17]。

2 RNA甲基化的檢測方法

雖然RNA甲基化的研究很早就已啟動，但由于技術上的限制一直停滯不前。直到最近幾年隨著高通量測序及分析化學工具的升級，加快了RNA修飾的研究。目前已開發了幾種用于檢測RNA甲基化的方法，有基于亞硫酸氫鹽修飾和非甲基化胞嘧啶化學修飾；有二代測序方法，如亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序；也有傳統的、經濟的基于PCR的方法，如利用擴增片段長度的多態性或限制性片段長度的多態性等。RNA結構和代謝的RNA甲基化鑒定需要與新穎的高通量方法相結合。由于經亞硫酸氫鹽處理后的非甲基化胞嘧啶殘基可轉化為尿嘧啶，m5C修飾可輕松被檢測到?；诖嗽?，已有多種檢測方法并廣泛使用。然而，與m5C不同，m6A甲基化無化學轉化過程，缺乏用于檢測RNA修飾及其靜態、不可逆性質的敏感方法。斑點印跡和高效液相色譜與三重四極桿質譜相結合可能成為檢測m6A修飾的有用工具。但這些技術不適合識別修飾位點的定位[18～23]。微量RNA全轉錄組m6A圖譜分析(m6A-seq/MeRIP-seq)，是一種免疫沉淀法，是識別m6A的重要工具，該工具具有準確性和可重復性，且所需的MeRIP-seq總RNA起始量低，僅需500 ng。通過與免疫沉淀反應相結合的極小RNA片段(100～200 nt)將m6A-seq/MeRIP-seq法進一步改進，分辨率進一步提高，可直接定位到單個核苷酸。改進后的方法被稱為單個m6A-核苷酸-拆分-交聯和免疫沉淀法(miCLIP)。miCLIP現已用于多種類型細胞及生物中m6A的定位，揭示其潛在功能[23]。此外，研究人員已建立可預測m6A甲基化信息的數據庫，名為RMBaseV2.0數據庫(http://rna.sysu. edu.cn/rmbase/)，其收錄了13個物種的多個RNA表觀遺傳修飾的測序數據及m6A甲基化的具體位點。隨著檢測m6A甲基化位點的技術不斷提高，為研究m6A甲基化與各類疾病的關系提供了實驗室依據。

3 m6A甲基化與腫瘤的關系

腫瘤的主要標志是基因表達的異常。m6A對控制細胞分化和多樣性有重要作用。最近研究強調，m6A不僅通過調控基因表達影響癌癥的發展，其還影響癌癥干細胞分化的多樣性，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、轉移和潛在的腫瘤免疫等過程，這使其成為一種新的、前景廣闊的腫瘤治療途徑[3，12,14]。

METTL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2被認為是不同類型腫瘤中的異常甲基化分子。目前研究報道較多的是造血干細胞，造血干細胞具有多種分化途徑以達到其最終分化狀態，m6A甲基化可改變其正常的分化途徑，并導致異常祖細胞狀態。研究表明，與正常人造血干/祖細胞(HSPCs)相比，急性髓細胞性白血病(AML)細胞中METTL3 mRNA和蛋白表達升高。下調AML細胞系中的METTL3基因表達,能誘導細胞凋亡和分化，從而延緩患者白血病的進展。與METTL3(m6A甲基轉移酶復合物的另一個關鍵組分)一樣，METTL14亦在正常HSPCs和AML細胞中高表達，并在骨髓分化過程中表達下調。在HSPCs和AML細胞中沉默METTL14基因可促進末端骨髓分化,并抑制AML細胞的存活和增殖[17,18]。

另一方面，作為m6A脫甲基酶(擦除蛋白)的FTO在部分AML細胞中高表達。在FTO介導的m6A RNA甲基化水平降低時mRNA穩定性同時降低，這將導致細胞因子信號傳導盒2和視黃酸受體α兩種基因表達受抑制，從而延緩AML發生發展。研究發現，降低m6A mRNA表達對于維持膠質母細胞瘤細胞(GSC)生長、自我更新和腫瘤發生發展至關重要。敲低METTL3或METTL14的表達能降低其靶基因m6A mRNA的表達。此外，通過抑制擦除蛋白FTO基因表達可抑制腫瘤進展并延長GSC移植小鼠的壽命。另外擦除蛋白ALKBH5基因還影響GSC細胞周期，ALKBH5在GSC組織中高表達，能使叉頭框蛋白M1(FOXM1)新生轉錄物去甲基化，這將影響mRNA的穩定性，導致FOXM1蛋白表達下降。FOXM1是FOX轉錄因子家族中的一員,在細胞周期中扮演重要角色。FOXM1特異性高表達于增殖期細胞和多數惡性腫瘤細胞中，但在細胞靜止、分化末期不表達[14,15,17]。

乳腺癌細胞MCF-7暴露于缺氧環境可刺激缺氧誘導因子HIF-1α和HIF-2α依賴性的去甲基酶(擦除蛋白)ALKBH5的表達。ALKBH5通過m6A去甲基化影響NANOG基因mRNA的穩定性。NANOG基因是一種多能性因子，2003年在胚胎干細胞中新發現的重要基因，是維持癌癥干細胞所必需的。所以，增加m6A去甲基化將會影響乳腺癌干細胞的表型。此外，乙型肝炎病毒X蛋白結合蛋白(HBXIP)能通過抑制乳腺癌中let-7g家族miRNA表達,上調讀取蛋白METTL3的表達，升高的METTL3又反過來增加HBXIP的表達，形成正反饋循環，導致乳腺癌細胞增殖加速。另一方面，在肝細胞癌(HCC)組織中，METTL3的過表達能抑制細胞因子信號轉導抑制因子2(SOCS2)，并通過m6A-YTHDF2途徑促進腫瘤生長。然而，m6A讀取蛋白的另一個成分METTL14能促進miR-126的表達，抑制腫瘤轉移。因miR-126可抑制HCC細胞轉移[18,19]。

結合蛋白YTHDF2的mRNA及蛋白在人胰腺癌細胞中較正常細胞表達上調，并通過Akt/GSK-3β/Cyclin D1信號通路，促進胰腺癌細胞增殖，同時通過抑制上皮細胞-間質轉化來抑制癌細胞的增殖、遷移和黏附。所以YTHDF2起到協調胰腺癌細胞遷移、增殖的作用。此外，m6A甲基化能影響前體RNA-premiR125b并降低成熟miR-125b表達，導致其靶基因產物如生長因子受體結合蛋白2表達增加，并促進癌細胞遷移[20～22]。

總之，m6A甲基化和腫瘤發生發展關系的研究目前尚處于起步階段，僅部分血液系統疾病、神經系統疾病等報道較多，其他報道較少[24～26]。主要原因為m6A甲基化過程所涉及的基因過多。m6A修飾過程需要讀取蛋白、擦除蛋白、結合蛋白這三類基因共同參與，且每種基因在不同癌癥中的表現可能千差萬別，如FTO基因在膠質母細胞瘤表現為癌基因，通過抑制FTO基因表達可抑制腫瘤進展；但在腎腫瘤或其他腫瘤組織中FTO可能為抑癌基因。此外由于擦除蛋白類的基因本身自帶去甲基化功能，過表達FTO基因，可能會導致細胞或組織m6A甲基化減少，反過來導致讀取蛋白或結合蛋白這兩類基因中的潛在癌基因或抑癌基因表達下調，將加速或減緩腫瘤發生發展。m6A甲基化過程在不同腫瘤中的表現可能千差萬別，需要進一步將研究精細化，并進一步了解讀取蛋白、擦除蛋白、結合蛋白在腫瘤中的作用機制及相互影響。另外，讀取蛋白、擦除蛋白、結合蛋白間的聯系，為研究提供了新的思路，對腫瘤的調控更精細化、多樣化，可同時實現對癌基因及抑癌基因的精準化、可逆化、動態調控。此外，m6A甲基化將腫瘤的診斷、治療提高到了分子水平。對m6A甲基化位點的研究可協助尋找新的分子診斷、治療的靶點，為臨床提供新思路。