簡述禽網狀內皮增生組織病毒危害及其P30蛋白免疫抑制功能

相英杰 陳宇桐 王一新

（山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271000）

1 禽網狀內皮組織增生癥綜述

1.1 病原學

REV屬反轉錄病毒科，γ逆轉錄病毒屬，禽C型腫瘤病毒。目前已經成功分離30多株REV，雖然不同菌株之間的致病性不同，但它們都具有相對一致的抗原，因此REV只具有一個血清型。除了REV-t菌株外，不同菌株之間有相似的結構和化學特征。根據單克降體試驗以及中和試驗反應等實驗，可將REV分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三個亞型，其中Ⅰ型具有A，B，C三個抗原表位，Ⅱ型只具有B抗原表位，Ⅲ具有A，B抗原表位。

1.2 流行病學

REV的主要宿主包括火雞，雞，鵝，鵪鶉等，最易感染火雞。REV主要感染日齡較低的雞。其既可以水平傳播，也可以垂直傳播，但主要依靠水平傳播。水平傳播的途徑包括病雞的排泄物和分泌物經口感染以及健康及接種受到RVE污染的弱毒疫苗。此外，吸血昆蟲也可傳播疾病。

1.3 致病機理及危害

目前，REV誘發雞體免疫抑制的分子機制目前尚未完全闡明。REV的P30衣殼蛋白由病毒gag基因所編碼，是RE的群特異性抗原團。REV可引起極強免疫抑制，其靶細胞為淋巴細胞或網狀內皮細胞，嚴重影響機體免疫系統，激活機體體液免疫和細胞免疫，降低機體對其他抗原免疫應答。

2 P30蛋白免疫抑制功能研究實驗

2.1 實驗目的

報道顯示，J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus-j，ALV-J）與REV同屬反轉錄病毒科，ALV-J的P27核衣殼蛋白能夠下調細胞因子、先天免疫接頭蛋白分子的表達水平，從而抑制宿主的先天免疫。因此推斷REV表層蛋白P30具有相同治病原理。

2.2 主要實驗試劑及器材

標準分子量蛋白 Marker、HRRP標記的抗體；瓊脂粉；脫脂奶粉、甲醇、電泳緩沖液、轉膜緩沖液；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒；SDS-PAGE Gel Kit；DMEM；鼠抗DTMUV抗體；其他試劑為國產分析純。

電熱恒溫培養箱；臺式恒溫振蕩器；各量程（最大量程分別為10 μl、50 μl、200 μl及1 000 μl）的微型移液器；臺式高速冷凍離心機；超凈臺；PCR儀；Gdldoc EQ凝膠成像儀；紫外分光光度計；蛋白垂直電泳槽與核酸水平電泳槽；CO2細胞培養箱；酶標儀；熒光定量PCR儀；倒置熒光顯微鏡；化學發光成像系統。

2.3 實驗步驟簡述

2.3.1 REV p30基因真核表達質粒的構建

將REV分離株LN1201感染CEF雞胚成纖維細胞被REV分離株LN1201感染，LN1201株p30基因序列通過PCR擴增，連入pcDNA3.1真核表達載體前經過雙酶切，構建p30基因的真核表達質粒pcDNA-p30。

2.3.2 真核表達質粒pcDNA-p30的瞬時表達和鑒定

將脂質體2000轉染到CEF。轉染72h后，以前期制備成功的小鼠抗REV P30多克隆抗體為一抗，以FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，鑒定pcDNA-p30的表達使用間接免疫熒光試驗（IFA）。同時，取另外一部分轉染了pcDNA-p30的CEF，先用RIPA裂解液裂解，再用濕轉法轉至PVDF膜，小鼠抗REV P30多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，通過western blot試驗鑒定其表達。

2.3.3 過表達p30蛋白對CEF細胞中細胞因子和抗病毒因子表達水平的影響

使用六孔培養板接種CEF細胞，培養過夜。后用脂質體2000，將真核表達質粒pcDNA-p30轉染CEF細胞，與此同時轉染空載體質粒pcDNA3.0作為對照。轉染48h后，加入20μl 濃度為1μg/ml的 LPS或者20μl濃度為5μg/ml的 poly（I：C）刺激細胞，在刺激后的第1、6、12、24和48h不同時間點分別收集細胞，通過real-time PCR檢測pcDNA-p30轉染CEF和空載體pcDNA3.0轉染CEF中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等細胞因子，以及MYD88、TAK1、IRAK-4、NF-κB、TRAF-6、IRF-7和TRIF等相關抗病毒因子的表達情況。最后，使用ELISA試劑盒，檢測細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等細胞因子的含量，分析REV P30蛋白對CEF先天免疫功能的抑制作用。

2.4 實驗結果

（1）RVE其衣殼蛋白P30免疫抑制功能原理與AVI-J的衣殼蛋白P27免疫抑制原理相似。

（2）REV的衣殼蛋白P30能夠下調細胞因子、先天免疫接頭蛋白分子的表達水平，從而抑制宿主的先天免疫。

2.5 實驗意義

REV具有較強的免疫抑制特性，目前對其誘發免疫抑制的分子機制尚未完全闡明。特別是對于REV抑制家禽先天免疫的作用及其分子機制目前還沒有研究報道。鑒于衣殼蛋白在其他反轉錄病毒中具有免疫抑制功能，明確REV P30蛋白的免疫抑制功能對于有效防控REV，全面理解家禽先天免疫功能提供科學資料。