嗜水氣單胞菌高免血清的制備及效價測定

崔 旭 黃春華

（1.重慶市石柱縣下路街道畜牧獸醫站，重慶 409100；2.重慶市石柱縣動物疫病預防控制站，重慶 409100）

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科，氣單胞菌屬。氣單胞菌屬根據有無運動力可分為兩類；一類是嗜冷性、非運動性的氣單胞菌，另一類為嗜溫性、運動性的氣單胞菌。嗜水氣單胞菌屬第二類，在氣單胞菌屬中是最重要的，它是氣單胞菌的模式種。非運動性氣單胞菌主要是對鮭鱒魚等致病的殺鮭氣單胞菌及其亞種。嗜水氣單胞菌在過去有不同的名稱，主要的名稱有點狀氣單胞菌和斑點氣單胞菌。嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、污水及土壤。有很多資料記載，嗜水氣單胞菌對水產動物、家畜和人均有致病性，在動物疾病學和食品衛生學研究上都具有重要意義。它能廣泛地被分離到，如在淡海水魚，淡水蝦類，淡水蟹類中和養殖蛙體內，也能引起爬行類疾病。有許多報道證明它也能感染人類發病，最常見的是嗜水氣單胞菌引起急性霍亂。同時，它廣泛分布于人類的食物鏈，供水系統和土壤中。

嗜水氣單胞菌既是恒溫動物與變溫動物的條件致病菌，又是原發致病菌。但是，AUSTIN等報道嗜水氣單胞菌通常在自然界是條件致病菌，充當繼發病原而不是原發病原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：嗜水氣單胞菌XS9141。

1.1.2 培養基：普通肉湯培養基，鮮血平板培養基。

1.1.3 藥品：甲醛 1%疊氮鈉

1.1.4 試驗動物：1.5～2㎏/只。

1.2 方法

1.2.1 菌種復壯：將菌種接種巧克力培養基中，在28℃的條件下培養24h，形成單個菌落。

1.2.2 疫苗的制備：挑取單個菌落到5ml普通肉湯培養基中，28℃振蕩培養24h，再倒入100ml普通肉湯培養基，28℃振蕩培養24h。涂片鏡檢、OD值的測定。然后加0.4%的甲醛溶液于37℃條件下滅活24h，每100ml加入1ml 1%疊氮鈉防腐，不加佐劑，制成非佐劑疫苗，4℃條件下保存。

1.2.3 免疫：取1.5kg左右的非免疫家兔四只，隨機分成兩組，每組兩只，實驗組和對照組。實驗組分五次免疫，耳靜脈注射，每次間隔7d，第一次注射0.5ml/只；第二次注射0.5ml/只；第三次注射1 ml/只；第四次注射1.5 ml/只；第五次注射2 ml/只；空白對照組不注射，同樣條件下飼養。

1.2.4 血清的分離與保存：每次免疫后間隔7d耳靜脈采血，五次免疫完后間隔14d采取心臟采血，常溫下靜置，待血液完全凝固后置4oC冰箱過夜析出血清，按0.01%的比例加入1%疊氮鈉防腐，充分混勻后按3ml每瓶分裝到無菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存備

1.2.5 檢測抗原的制備：將嗜水氣單胞菌，接種于5ml普通肉湯，在28℃的條件下震蕩培養24h后，將菌液轉入盛裝有50ml普通肉湯的三角燒瓶中，在28℃的條件下震蕩培養24h，取出。將上述菌液在4000r/min 離心20min，取上清液，裝入無菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存備用。

1.2.6 抗體效價的測定：采用凝集試驗檢測抗體效價。參照Roberson的方法做微量板凝集試驗。在96孔u型板上用PBS緩沖液倍比稀釋待檢血清，使終容量為100μl/孔，并以PBS緩沖液孔作陰性對照；然后加入抗原，50μl/孔，4℃ 過夜，判斷結果如圖1。

2 試驗結果

本試驗主要是通過將嗜水氣單胞菌接種到巧克力培養基里復壯后制成非佐劑疫苗，采用耳靜脈注射，免疫非免疫家兔誘發產生免疫力制備高免血清，采用凝集試驗檢測抗體效價。第7天凝集效價為1：16，第14天凝集效價為1：64，第21天凝集效價為1：512，第28天凝集效價為1：1024，第35天凝集效價為1：2048，第42天凝集效價為1：2048，結果顯示最高凝集效價是1：2048。對照組沒有檢測到嗜水氣單胞菌的抗體。

3 分析討論

（1）實驗結果顯示，家兔在第一次免疫后的第7天就能檢測到凝集效價，第二次、第三次、第四次的凝集效價都比前一次的要高，在第四次、第五次和第六次檢測時結果顯示已經保持平衡，不在增加，最高凝集效價也就在第四次檢測出為1：2048。而對照組沒有檢測到凝集效價。

在注射劑量的選擇時第一次和第二次都是用0.5ml，以后每次遞增0.5ml，因為注射途徑是耳靜脈注射，直接進入血液，如果第一次的注射劑量過大，會造成實驗動物無法適應，從而引起一些不適應癥或死亡，要有一個過渡階段，這樣免疫效果才會更佳。

通過結果顯示，28d的效價高于21d，21d的效價又高于14d，14d的效價又高于7d，而每次的劑量和時間都在原有的基礎上有所增加，應此我們可以推測凝集效價的高低與劑量和時間有關。28d、35d和42d的效價都為1：2048，第五次注射的劑量比第四次的要高時間要長，但效價卻沒有增加，這可以說明效價達到一定高度的時侯凝集效價就不在增加。

（2）目前，對其他菌的高免血清的研究較多，但是對嗜水氣單胞菌高免血清的研究的文獻報道還沒有，本試驗所產生的數據可為嗜水氣單胞菌高免血清研究提供參考、依據。

（3）目前，檢測抗體的方法有很多，如：瓊脂雙向擴散試驗、免疫熒光試驗、血清中和試驗等。但凝集試驗所需設備簡單，操作方便、易行，現象明顯，易于觀察。于是本次試驗采用了凝集試驗檢測血清抗體效價。

4 結論

從本試驗看，嗜水氣單胞菌中含有可以使機體產生抗體的物質，而本試驗采用的免疫方法可以使這些物質刺激機體產生抗體。