血管平滑肌細胞表型轉化的誘導因素研究進展

胡艷紅，楊靜，修成奎，王雪，方靖漪，王佳麗，劉奕清，雷燕

(1 中國中醫科學院醫學實驗中心/北京市中醫藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室，北京100700；2 廣東藥科大學中醫藥研究院/廣東省代謝性疾病中西醫結合研究中心)

血管平滑肌細胞(VSMCs)是一種來自胚胎發育時期中胚層的多功能性間葉細胞，周圍由細胞外基質包圍。VSMCs是大、中動脈中膜的主要組成部分，是保持血管壁的完整性以及維持血管張力的重要因素，可調節血壓、血流量。研究[1]顯示，VSMCs異常增殖和遷移造成的表型轉化在心腦血管疾病中起著關鍵作用，是動脈粥樣硬化、高血壓、心衰、腦梗和血管動脈瘤等疾病的重要病理過程之一。選擇適宜的誘導因素是探討VSMCs表型轉化的分子機制、研發相關血管保護作用藥物的重要支撐。VSMCs表型轉化的誘導因素眾多，如氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、高糖、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、晚期糖基化終末產物(AGEs)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)等，已被成功應用于建立VSMCs表型轉化模型。但不同模型的分子機制和病理因素各不相同，本研究通過整理目前較常用的VSMCs表型轉化誘導因素，深入探討其分子機制，為以后靶向VSMCs的藥物篩選以及具有相關抑制作用的中草藥的研究和開發提供參考。

1 VSMCs表型

1989年，Baumbach等首次提出“血管重塑”，發現血管的病理生理過程不僅是血管壁形態結構的改變，還有細胞的改變如VSMCs表型轉化，從此VSMCs表型轉化開始進入人們的視野[2]。與骨骼肌和心肌細胞不同，VSMCs是一種非終末分化的高度特異性細胞，其表型具有可調控性，通過分化或去分化可實現表型和功能的轉化。根據VSMCs形態、功能及細胞標志蛋白的不同，VSMCs表型分為收縮表型(又叫分化表型)和合成表型(又叫去分化表型)兩種。生理狀態下，VSMCs處于分化程度較高的收縮表型，當血管內膜受損或VSMCs受到生長因子、機械作用、血管活性物質等因素刺激時，VSMCs從收縮表型轉化為分化程度較低的合成表型，這一轉化過程被稱之為表型轉化。VSMCs表型轉化的過程十分復雜，機制尚未完全闡明清楚，現大量證據表明其受多條信號轉導通路的調節，如MAPK、PI3K/AKT、TGFβ/Smad、RhoA/Rock、Raf/MEK/ERK1/2以及cAMP/PKA通路等等。

1.1 收縮表型VSMCs 正常情況下，VSMCs分化為不同的細胞群并獲得具有成年特征的收縮表型，處于終末分化階段，是一種穩定性表現。收縮表型VSMCs增殖、遷移活性較低，是保持血管的完整性及維持血管張力的重要因素，多出現在胚胎初期和正處于生長發育的器官。收縮表型VSMCs處于高分化狀態，一般呈紡錘形，長度變異較大，其胞質內含有豐富的肌纖維，并可見致密體及致密斑，粗面內質網、高爾基體和線粒體等細胞器較少，僅產生極微量的細胞外基質，胞膜外環繞一層基底膜。收縮表型VSMCs有一些特異性標志物，如平滑肌22α(SM22α)[3]、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)[4]、調寧蛋白1(CNN1)、平滑肌特異性蛋白(smoothelin)以及鈣調素結合蛋白(caldesmon)等。血清應答因子(SRF)是VSMCs收縮表型的主要調節因子，與MyoC、MRTF轉錄共激活因子一起負責維持VSMCs的收縮表型。此外，小G蛋白超家族的亞家族成員如RhoA，可增加MRTF的肌動蛋白依賴性核轉位，在調節VSMCs收縮表型中也發揮重要作用。

1.2 合成表型VSMCs 分化成熟后的VSMCs在血流動力學變化、血管活性物質改變、炎性介質和細胞因子等刺激下可以去分化，成為分化程度低的合成表型[5]。合成表型VSMCs形態上類似成纖維細胞，呈扁平形，主要表現為細胞體積增大、肌絲含量少、結構蛋白少、收縮功能明顯減弱，粗面內質網、高爾基體及游離核蛋白體等細胞器增多，并獲得異常增殖[6]、遷移[7]、凋亡的能力。合成表型VSMCs大量合成和分泌細胞外基質如基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)等活性物質，促使內皮細胞功能失調，誘導血管炎性改變，可導致血管壁增厚、管腔狹窄、血管重構、血管老化，進而引起終末器官血流灌注不足、功能異常甚至衰竭[8，9]。合成表型VSMCs主要位于胚胎中期血管或病理血管中，可表達一些成骨分化的標記物，如骨形態發生蛋白2(BMP-2)、Runt-相關轉錄因子-2(Runx2)、msh同源異型盒基因2(MSX-2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)、骨保護素(OPG)、基質Gla蛋白(MGP)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、成骨特異性轉錄因子(Osterix)、上皮調節蛋白(epiregulin)以及骨鈣素(OCN)等[10～12]。

2 VSMCs表型轉化的誘導因素

2.1 ox-LDL ox-LDL是血漿中低密度脂蛋白被氧化后的產物。當細胞內活性氧(ROS)水平升高，或者在二價過渡金屬陽離子存在的情況下，均會發生低密度脂蛋白(LDL)氧化。ox-LDL可損傷血管內皮細胞，增加多種細胞黏附分子的表達，促進單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞的黏附、遷移和浸潤。研究[13]發現，ox-LDL通過清道夫受體被單核細胞等大量吞噬轉化成泡沫細胞，可增加斑塊粥樣脂質含量，從而提高斑塊的不穩定性；ox-LDL還可提高VSMCs內ROS的水平，降低超氧化物歧化酶(SOD)活性，刺激VSMCs增殖及向內膜遷移，促進細胞成骨樣分化和鈣化，從而干擾其表型，是導致動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病發生的重要因素。研究[14]顯示，ox-LDL可以濃度依賴性方式增加核心結合因子a1(CBFA1)mRNA表達，降低SM22α mRNA表達，增加茜素紅S染色，促進VSMCs的鈣化，加速VSMCs表型轉化；可通過增加骨相關蛋白mRNA表達，降低VSMCs中收縮蛋白的表達，刺激NK-κB p65的核轉位，促進VSMCs表型轉化；ox-LDL還可使MMP-2和MMP-9合成增加，上調pERK1/2表達，促使VSMCs遷移并向合成表型轉化；ox-LDL可通過調節Wnt/β-連環蛋白信號傳導途徑，降低miR-148b表達，干擾其表型[15]；ox-LDL可通過干擾細胞周期，增加S期VSMCs百分比，降低G1和G2期細胞百分比，下調Wnt、β-連環蛋白和細胞周期蛋白D1的蛋白表達水平，促進VSMCs增殖和遷移，誘導VSMCs發生表型轉化[16]。最近，也有研究[17]發現，p38、ERK1/2/MAPK和核因子κB(NF-κB)等信號通路的激活，也影響細胞周期，還可調節增殖細胞核抗原(PCNA)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達，參與ox-LDL誘導的VSMCs表型轉化的發生。

2.2 高糖 在糖尿病患者中，長期高糖血癥是導致心腦血管并發癥發生、危害人體健康的重要因素，其中VSMCs表型轉化是糖尿病心腦血管并發癥的重要細胞生物學基礎。長期高血糖除可引起內皮損傷、血小板黏附，導致血栓形成外，受損處也可聚集大量炎性細胞，從而釋放大量炎性因子，刺激VSMCs出現異質性變化，發生增殖、遷移、表型轉化與分泌性改變，合成釋放大量細胞基質，促使血管功能失調與血管炎性改變，最終可導致動脈粥樣硬化等血管性疾病的發生。VSMCs表型轉化的機理非常復雜，多種生長因子和細胞因子以旁分泌/自分泌的方式參與了此過程，促進VSMCs增殖，進一步促進VSMCs表型由收縮表型轉為合成表型，形成一個復雜的因子網絡。高糖可通過多種信號轉導系統，影響VSMCs的功能，誘導VSMCs表型轉化。比如激活PKC、STAT3/Pim-1信號通路[18]；促使p38MAPK/JNK ERK磷酸化，提高SOD和丙二醛(MDA)水平，促使ROS大量產生，引起VSMCs過度增殖和遷移[19]；誘導轉運蛋白(TSPO)高表達，加速VSMCs增殖和遷移，干擾細胞表型；通過促使多功能蛋白聚糖(VCAN)大量產生，調節線粒體膜電位或線粒體功能，也可顯著增加乳酸脫氫酶(LDH)活性以及MDA含量，刺激VSMCs氧化應激[20]，導致VSMCs表型轉化，加速血管鈣化、衰老；激活ROCK1通路，促使miR-145表達逐漸減少，增殖、遷移逐漸增多，干擾VSMCs表型分化；增加瞬時受體電位M7(TRPM7)蛋白表達和TRPM7全細胞電流，并通過活性氧-TRPM7-ERK1/2軸影響VSMCs分化標志物如α-SMA、SM22α和OPN的蛋白表達；和牙齦卟啉單胞菌一起作用于人主動脈血管平滑肌細胞(HASMCs)[21]，可上調由toll樣受體4和ERK1/2-p38信號傳導介導的骨形成蛋白-4(BMP4)的表達，繼而通過自分泌作用繼續上調骨形成蛋白-4(BMP4)特異性下游smad1/5/8-runx2信號傳導，增加骨相關基質蛋白的表達，促使HASMCs表型轉化，加速血管鈣化；激活通路如Ras/Raf/MEK/MAPK、NADPH氧化酶途徑[22]介導ROS產生。相較于持續性高糖，波動性高糖更能增強MMP-2活性、OPN的表達，干預細胞周期，對caspase-3等凋亡蛋白加以調控，促進VSMCs不斷增殖，逐漸誘導其進入表型轉化狀態。

2.3 Ang Ⅱ Ang Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中的主要活性物質，生理條件下可以維持血管管壁緊張度來穩定血壓，也可以刺激醛固酮的合成和分泌，維持水電質平衡和內環境穩態，但Ang Ⅱ的異常增高參與了高血壓、動脈粥樣硬化、血管纖維化、血管狹窄等的病理進程，Ang Ⅱ可以誘導血管平滑肌細胞的炎癥、遷移、增殖、細胞外基質合成，使細胞從收縮型轉變為合成型。Ang Ⅱ與Ang Ⅱ 1型受體(AT1R)結合后，可進一步激活下游通路如Wnt4/DVL-1/β-catenin導致VSMCs表型發生改變，從而促進VSMCs的增殖、分泌及遷移活性。Ang Ⅱ還可作為一種生長因子，降低抑制蛋白質精氨酸甲基轉移酶2(PRMT2)的mRNA和蛋白水平，誘導其他促炎性細胞因子如IL-6和IL-1β的表達，為Ang Ⅱ介導的VSMCs表型轉化提供了一種新機制。Ang Ⅱ通過多種途徑誘導VSMCs表型轉化：通過AT1R/RhoA/Rho激酶依賴性機制，增加Beclin-1、Vps34、Atg-12-Atg5、Atg4和Atg7蛋白水平，減少α-SMA表達[23]；激活RhoA/ROCK通路，誘導F-肌動蛋白細胞骨架重塑[24]；通過Ca2+內流介導的Pyk2-ERK1/2-Elk-1途徑，提高TRPM7的表達，降低收縮標志物SM22α的表達，誘導VSMCs表型轉化；激活JAK/STAT3通路，通過干擾細胞周期，促進增殖和遷移；通過增加線粒體氧化應激介導線粒體功能障礙，刺激酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(Nox1)激活，最終導致VSMCs表型轉化，加速細胞衰老；通過調節Rac1激活和Nox1表達促進二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)的激活，也可誘導ROS的產生，從而激活MAPK(Erk1/2、p38和Jnk)途徑，干擾血管表型。

2.4 AGEs AGEs是指多種大分子(蛋白質、脂肪酸或核酸等)經非酶性糖基化反應，自發地與還原單糖作用形成穩定且不可逆的非均質分子復合物，是過量的糖和蛋白質結合的產物。生理狀態下，人體內AGEs的表達量很低，而糖尿病患者由于機體長期處于高血糖狀態，促使非酶性糖基化反應加快，導致AGEs的生成異常增多，現已成為誘導VSMCs表型轉化、加速血管老化的重要因素。晚期糖基化終末產物受體(RAGE)是一種介于細胞膜與細胞質之間的跨膜蛋白。已有研究[25]證實，AGEs可以通過配體-受體結合方式結合細胞膜上的RAGE，激活下游wnt/β-catenin、NF-κB、cdc42/rac、JAK/Stat、ERK1/2和p38 MAPK信號通路，誘導氧化應激，促使VSMCs增殖、遷移，干擾VSMCs的收縮表型，是研究糖尿病相關血管性疾病的重要機制。AGEs作用于VSMCs，可上調細胞表面NOX1、NOX4、p22phox、p67phox、LRP1、CD36、RAGE等的表達，誘導細胞促氧化和炎性產生，促使VSMCs增殖；通過HIF-1α/PDK4途徑，可促使堿性磷酸酶(ALP)和RUNX2活性增強，誘導VSMCs表型轉化，是改變VSMCs中葡萄糖代謝的新機制。

2.5 TNF-α 血管中的內皮細胞受損時，可釋放大量的炎性因子，引起VSMCs增殖、遷移，誘導表型轉化，最終形成動脈粥樣硬化。其中TNF-α作為一種重要的前炎性細胞因子，主要由巨噬細胞產生，由細胞表面模式識別分子受體(如Toll樣受體)結合模式識別分子(如LPS)介導產生，能活化中性粒細胞和單核細胞，從而促進血管內皮細胞表達黏附分子、炎癥遞質等多種生物學活性。TNF-α與VSMCs表面上的受體相結合可刺激血小板源性生長因子(PDGF)分泌，促使VSMCs增生導致內膜增生。TNF-α可提高VSMCs中VCAM-1表達以及單核細胞黏附，刺激MAPK磷酸化和NK-κB活化，增加IL-6和IL-8水平，導致VSMCs表型轉化和血管炎癥，加速動脈粥樣硬化[26]。TNF-α可通過NF-κB介導的Syndecan-4的基因和蛋白表達，激活syndecan-4/FGF-2/TGFβ信號軸促進VSMCs增殖、遷移，加速其表型轉化。TNF-α刺激VSMCs可顯著增強Krüppel樣因子5(KLF5)啟動子的活性以及mRNA水平，并下調SM22α和α-SMA的表達，而KLF5過表達可減弱SM22α和α-SMA的下調，提示TNF-α依賴的KLF5誘導可能在VSMCs的表型調節中起重要作用。此外，TNF-α可通過激活p44/42 MAPK誘導VSMCs增殖、遷移；激活PI3Kγ/p-Akt通路，下調VSMCs收縮基因的表達；還可以通過影響血小板衍生生長因子受體β(PDGFRβ)、ERK1/2和Akt磷酸化，誘導VSMCs向膠原蛋白遷移，加速血管損傷。

2.6 PDGF-BB PDGF是由Ross于1973年在血小板α顆粒中發現并純化出來，是血管損傷處的巨噬細胞和血小板等釋放的強效細胞因子，是一種重要的促分裂劑[27]。PDGF是由A、B鏈聚合而成3種構型的二聚體，即PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB，起到強有絲分裂原和化學趨化劑的作用，使VSMCs、成纖維細胞、膠質細胞和巨噬細胞表達高親和性受體。其中，PDGF-BB在正常血管中無表達，但在動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄等引起內皮細胞損傷后則明顯上調，對干擾VSMCs表型轉化、血管重構起著非常重要的作用。研究[28]發現，PDGF-BB可從多種途徑誘導VSMCs表型轉化，如產生大量ROS，促使ERK1/2、蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)或JAK2ERK磷酸化增加，使G1期細胞周期停滯，降低SM22α、α-SMA的表達，上調OPN表達，導致F-肌動蛋白的結構紊亂、不規則，誘導VSMCs表型轉化。PDGF-BB還可刺激LncRNA CRNDE高表達，下調SM-MHC和α-actin蛋白表達，促使VSMCs增殖和遷移，以干擾VSMCs表型轉化。研究[29]顯示，PDGF-BB可誘導miR-26a表達顯著增加，靶向Smad1通過BMP/TGF-β途徑，調節VSMCs表型分化標志物基因如α-SMA、SM-MHC和鈣調蛋白的表達。研究[30]顯示，PDGF-BB可顯著下調miR-320的表達，通過靶向NRP1調節VSMCs的增殖和遷移。研究[31]表明，PDGF-BB可通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、MMP-9、細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E下調p27KIP1蛋白表達，刺激VSMCs增殖和遷移，還可誘導黏著斑激酶(FAK)和Src激酶的磷酸化，促使氧化應激的發生，導致線粒體功能障礙，擾亂VSMCs表型。最新研究[32]發現，miR-1181在大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)中可被PDGF-BB顯著下調，通過靶向信號轉導與轉錄激活因子(STAT3)影響細胞周期從G0/G1向S期的轉變，誘導PASMC的過度增殖，是導致肺動脈高壓發生和發展的關鍵因素。

綜上所述，VSMCs表型轉化是一個受多種因素調控的復雜過程，ox-LDL、高糖、Ang Ⅱ、AGEs、TNF-α、PDGF-BB等因素可誘導VSMCs表型轉化。VSMCs表型轉化的機制十分復雜，各種信號通路相互交叉，但目前對其研究尚不是十分明確，且整體動物實驗方面缺乏相應的研究數據。中藥在心腦血管疾病的防治取得一定療效，如中藥復方益氣活血湯、補陽還五湯、麝香保心丸，單味中藥黃芪、當歸、紅花、郁金，中藥有效組分大豆異黃酮、粉防己堿、甲基蓮心堿、絞股藍總苷、吳茱萸次堿等在抑制VSMCs表型轉化方面已得到國內學者越來越多的認識及深入研究。但中藥也由于其成分復雜及不良反應，致使作用機制難以明確，質量難以控制，限制了其在臨床上的大量推廣。這就要求我們要加大對VSMCs表型轉化誘導因素的探索，從而加強中藥在治療心腦血管疾病動物模型上的相關研究深度，填補體內或臨床試驗空白。從而更加準確地研發相關的候選藥物，最終為心腦血管系統疾病提供新的治療手段。