卵巢癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31的表達變化及其臨床意義

劉晶晶，陸娟，張彬彬，李丹

(本溪市中心醫院，遼寧本溪117000)

卵巢癌是臨床上較為常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，其發病率在所有女性生殖系統惡性腫瘤中位居第3位，其中上皮性卵巢癌在卵巢癌中是最常見的病理類型。由于卵巢癌在發病早期具有較強的隱匿性，且易出現多臟器的癌細胞增殖、淋巴結轉移等，患者5年生存率僅為30%左右，病死率在所有婦科惡性腫瘤中位居首位[1]。研究[2]發現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)介導機體多種復雜生物學過程，在染色質調控、重塑以及組蛋白修飾、基因組印跡等方面發揮著至關重要的作用。研究[3]顯示，長鏈非編碼RNA漿細胞瘤移位基因1(lncRNA-PVT1)位于染色體8q24.21上，在鼻咽癌、前列腺癌以及乳腺癌等多種腫瘤中表達升高,其可在轉錄水平、轉錄后水平及蛋白質水平影響下游癌基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等行為。微小RNA(miR)是細胞內小的非編碼RNA分子，長度約為18～25個核苷酸，可結合靶基因mRNA的3′端非翻譯區，降低mRNA的穩定性，調控基因表達，影響細胞的發育、分化、增殖和凋亡等生物學行為。研究[4]發現，miR-31在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中呈明顯低表達，miR-31通過結合并抑制Ras同源基因家族成員A(RhoA)等基因的mRNA的表達，抑制下游信號傳導通路的傳導，發揮抑制增殖、浸潤、轉移的作用。有研究[5，6]表明，lncRNA-PVT1能夠作為分子海綿結合并抑制miR-31的表達，導致miR-31失去對下游周期素依賴性激酶1(CDK1)的表達抑制作用，促進腫瘤細胞的惡性增殖。本研究觀察了卵巢癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31的表達情況，分析兩者間的相關性及與卵巢癌患者臨床病理參數的關系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年2月～2017年2月本溪市中心醫院收治的卵巢癌患者93例，年齡41～77歲，平均年齡(58.23±10.73)歲，其中FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期61例、Ⅲ～Ⅳ期32例，高分化26例、中分化34例、低分化33例，腹膜轉移59例、淋巴結轉移44例，組織學類型為漿液性53例、非漿液性40例，腫瘤直徑<2 cm者31例、腫瘤直徑≥2 cm者62例。患者均接受手術治療，術中留取癌組織及癌旁組織，迅速置于凍存管內，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。納入標準：①研究對象均經手術病理組織活檢確診為卵巢癌,均符合2009年國際婦產科聯盟(FIGO)診斷標準[6]；②既往無放化療及免疫治療病史；③無臨床病歷資料缺失。排除標準：①合并其他惡性腫瘤疾病者；②伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；③交流溝通障礙或伴有精神疾病者。本研究獲得研究對象同意，并得到醫院倫理委員會批準。

1.2 卵巢癌組織及癌旁組織中lncRNA-PVT1、miR-31檢測方法 取50 mg組織標本，采用TRIzol法提取癌組織及癌旁組織總RNA。取1 μg總RNA，采用TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA，并采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增。引物序列如下：lncRNA-PVT1上游引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物為5′-AGAGCACCAAGACTCGCTCT-3′；GAPDH的上游引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物為5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；miR-31上游引物為5′-GTTGGAGACGACGCAAGAT-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環37次。將GAPDH作為lncRNA-PVT1的內參，以U6作為miR-31的內參，以2-ΔCt表示目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 卵巢癌組織與癌旁組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達比較 卵巢癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31的相對表達量分別為3.10±0.24、0.53±0.12，癌旁組織中lncRNA-PVT1、miR-31的相對表達量分別為1.02±0.17、0.94±0.14，兩者相比，P均<0.05。

2.2 卵巢癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達的相關性 卵巢癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達呈負相關關系(r=-0.672，P=0.012)。

2.3 癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達與卵巢癌患者臨床病理參數的關系 癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達與卵巢癌患者臨床病理參數的關系見表1。表1顯示，lncRNA-PVT1、miR-31表達與卵巢癌患者腫瘤FIGO分期、腹膜轉移及淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

3 討論

卵巢癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命。由于該病早期缺乏明顯的臨床表現，因此約70%的卵巢癌患者一經確診便已是中晚期或發生遠處轉移，喪失手術根治的最佳時機，預后較差[7]。因此，尋找卵巢癌發生發展相關的關鍵驅動因子并確定其作用機制，對卵巢癌的臨床診斷和治療具有重要的價值。非編碼RNA(ncRNA)是近年發現的調控基因表達的重要分子，包括lncRNA、miRNA及環狀RNA等，能夠在轉錄、轉錄后、翻譯及蛋白水平調控靶基因的功能，參與細胞發育、分化等過程[8],在腫瘤、自身免疫性疾病及神經退行性疾病中均發揮重要的調控作用，有望成為疾病診斷、治療的重要靶點[9]。

表1 癌組織中lncRNA-PVT1、miR-31表達量與卵巢癌患者臨床病理參數的關系

lncRNA屬于近年來所發現的一類長度≥200核苷酸的新型RNA分子，其不具有編碼蛋白質的功能，但廣泛參與了機體的基因表達調控、蛋白復合體啟動、亞細胞結構構建以及腫瘤細胞侵襲轉移等多種復雜的生物學行為過程[10]。研究[11]顯示，lncRNA-PVT1在多種腫瘤中表達增高，可通過參與DNA重排、編碼miRNA以及與MYC蛋白相互作用參與細胞表達調控，促進腫瘤細胞的增殖、浸潤及遠處轉移。本研究結果顯示，卵巢癌組織中lncRNA-PVT1表達明顯高于癌旁組織，其機制可能是腫瘤發生時原癌基因MYC表達增加，而MYC蛋白能夠結合PVT1基因啟動子區域的E盒區，促進PVT1基因的表達[12]。此外，本研究結果顯示，卵巢癌患者lncRNA-PVT1表達還與FIGO分期、腹膜轉移及淋巴結轉移密切相關，其機制可能是lncRNA-PVT1通過影響癌基因及抑癌基因重排，發揮促進腫瘤增殖作用。研究[13]發現，lncRNA-PVT1能夠促進含WW結構域的氧化還原酶(WWOX)等抑癌基因的基因重排，導致WWOX基因失活，促進腫瘤細胞的增殖，導致分期增高。研究[14]顯示，lncRNA-PVT1可直接結合并抑制miR-200a和miR-200b，而miR-200a和miR-200b抑制MMP9表達，lncRNA-PVT1以轉錄后調控的方式上調MMP9表達，促進腫瘤的浸潤和轉移的發生，導致腫瘤發生腹膜轉移和淋巴結轉移。

miRNA是一類廣泛表達于真核生物內的小分子單鏈非編碼RNA，成熟的miRNA參與構成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，通過堿基配對的方式結合靶基因mRNA的3′端非翻譯區，改變mRNA的穩定性，調控基因表達[15]。miR-31作為miRNA的一員，能夠抑制磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸激酶1(PI3K/AKT)信號通路中PI3K等多種關鍵癌基因表達，發揮抑癌基因的作用。多項研究[16]證實，miR-31在肝癌、肺癌等多種腫瘤中均存在表達下降的現象，miR-31表達降低導致配對盒基因9(PAX9)表達增加，最終促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等生物學過程。本研究中，miR-31在卵巢癌組織中的表達水平明顯較癌旁正常組織低，其表達降低的機制可能與miR-31基因啟動子區表觀遺傳學修飾后導致基因表達沉默有關。有研究[17]報道，腫瘤細胞中miR-31基因啟動子區的甲基化導致miR-31表達降低，進而導致下游轉錄因子1(E2F1)表達增高，促進腫瘤細胞增殖。此外，本研究結果顯示，miR-31表達與卵巢癌患者的FIGO分期以及腹膜轉移、淋巴結轉移存在密切相關，可能是因為腫瘤細胞中miR-31可通過直接抑制大腫瘤抑制基因2(LATS2)的表達，促進調控上皮間質轉化過程中的關鍵轉錄因子的表達，導致腫瘤細胞向間質性表型轉化，促進腫瘤的增殖及轉移。

有研究[6]報道，腫瘤細胞中的lncRNA-PVT1能夠作為分子海綿結合并抑制miR-31的表達，從而發揮對miR-31下游增殖、轉移相關癌基因的表達調控作用。本研究進行相關性分析可得，卵巢癌組織中lncRNA-PVT1表達與miR-31表達呈明顯負相關關系，與相關研究結果一致，但目前兩者相互作用的機制尚不清楚。

綜上所述，卵巢癌組織中lncRNA-PVT1高表達，而miR-31低表達，兩者負相關，兩者表達與卵巢癌患者腫瘤FIGO分期、腹膜轉移及淋巴結轉移有關，有可能成為新的卵巢癌診斷標志物，可用于輔助判斷卵巢癌的進展情況，但兩者在卵巢癌發生發展過程中的作用機制有待深入研究。