外源性鋅離子培養/低氧環境下大鼠Müller細胞活力、鋅離子濃度變化及促紅細胞生成素的調節作用觀察

康道歡，史彩平

(浙江大學醫學院附屬兒童醫院/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心，杭州310003)

鋅離子在視網膜上的含量較高，主要分布于視網膜色素上皮細胞和膠質細胞，并且在調節突觸傳遞、抗氧化應激反應中起重要作用。研究[1]表明，暗適應的破壞、黃斑變性等與人體內鋅離子缺乏導致的視網膜抗氧化劑減少有關。鋅離子同樣可以降低糖尿病患者中脂質過氧化反應和谷胱甘肽水平[2]。研究[3]表明，促紅細胞生成素(EPO)具有保護缺氧狀態下視網膜神經和血管的作用，EPO可以通過抑制HIF-1α的表達起抗VEGF的作用[4]。研究[5]發現，EPO及其受體在視網膜中表達，并且EPO對視網膜神經節細胞的保護存在劑量關系。在低氧誘導的視網膜中，EPO通過抗凋亡途徑來保護一過性缺血缺氧和再灌注損傷，同時EPO還可以通過降低炎性因子(TNF-α、IL-1β)的表達改善缺氧性視網膜病變中的炎性反應[6]。鋅離子轉運體8(ZnT8)在視網膜上表達，主要表達于視網膜色素上皮細胞、Müller細胞。已有文獻報道ZnT8在糖尿病患者靜脈血[7]及糖尿病大鼠視網膜中的表達下降，并且抑制HIF-1α的表達可以增加ZnT8的表達。本研究通過在大鼠Müller細胞系rMC-1中加入氯化鋅(ZnCl2)及EPO，觀察外源性鋅離子、EPO對大鼠Müller細胞系rMC-1細胞活力、細胞凋亡率影響，并在此基礎上，通過在rMC-1細胞中加入氯化鈷(CoCl2)誘導低氧環境[8]，觀察低氧環境、EPO對rMC-1細胞中鋅離子濃度、ZnT8表達的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 加入外源性鋅離子培養的大鼠Müller細胞系rMC-1細胞活力及EPO調節作用觀察

1.1.1 細胞培養、分組及鋅離子和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min后，轉移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養基的培養皿中，置于37 ℃培養箱中傳代培養3～4代。取生長狀態良好的rMC-1細胞，按1 000個/孔接種于96孔板中，分成3組，分別記為ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組，分別加入ZnCl2、ZnCl2+EPO、等量培養基，每組設6個復孔。ZnCl2組ZnCl2終濃度為125 μmol/L，ZnCl2+EPO組ZnCl2終濃度為125 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.1.2 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組細胞活力觀察 采用MTT法。各組細胞繼續培養24 h后，PBS清洗一次，加入0.5 mg/mL的MTT溶液孵育4 h，移去上清液，保留結晶體，每孔加入100 uL DMSO，37 ℃搖床低速振蕩10 min，選擇490 nm為主波長，570 nm為參比波長，在酶標儀上測定各孔的光密度值(OD值)，計算細胞活力。細胞活力=OD值(490 nm)/OD值(570 nm)。實驗重復3次，取平均值。

1.1.3 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組細胞凋亡率觀察 采用TUNEL法。各組細胞繼續培養24 h后，PBS漂洗細胞2次，蛋白酶K(20 μg/mL)室溫孵育5 min，PBS漂洗2次；加入50 μL TUNEL反應混合液于標本上，在37 ℃暗濕盒中孵育1 h；PBS漂洗2次，DAPI(2 μg/mL)室溫下孵育5 min染核，熒光顯微鏡下觀察，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=熒光細胞數/總細胞數×100%。

1.2 低氧環境下大鼠Müller細胞系rMC-1細胞內鋅離子濃度變化及EPO的調節作用觀察

1.2.1 細胞培養、分組及CoCl2和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min，解凍后轉移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養基的培養皿中，置于37 ℃培養箱中傳代培養3～4代。取生長狀態良好的rMC-1細胞接種于蓋玻片上，分成3組，分別記為CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組，分別加入CoCl2(誘導低氧環境)、CoCl2+EPO、等量培養基。CoCl2組CoCl2終濃度為200 μmol/L，CoCl2+EPO組CoCl2終濃度為200 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組鋅離子濃度觀察 采用鋅離子探針FluoZin-3 AM檢測低氧環境及EPO對rMC-1細胞內鋅離子濃度的影響。各組細胞繼續培養24 h后，在37 ℃條件下加入FluoZin-3 AM(5 μmol/L)孵育1 h，PBS清洗1次，然后將蓋玻片換成新鮮培養基，37 ℃下繼續培養30 min，DAPI染核5 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAKO封片，熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光情況。取1×105個rMC-1細胞于熒光比色杯中，用熒光分光光度計檢測在激發波長為365/490 nm處的熒光強度，以熒光強度表示細胞內鋅離子濃度。

1.2.3 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞內ZnT8表達影響觀察 ①采用qRT-PCR法檢測各組rMC-1細胞內ZnT8 mRNA。各組細胞繼續培養24 h后，棄培養基后用蛋白酶溶解收集細胞，TRIzol試劑提取RNA，取500 ng RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA作為模板，進行PCR擴增，PCR總反應體積20 μL。引物序列如下：ZnT8正向引物為5′-AAGTGGAGACTCTGTGCTGCTTCA-3′,反向引物為5′-GGCCTCGATGACAACCACAAAGAA-3′,β-actin正向引物為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,反向引物為5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。PCR擴增條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃繼續延伸40 s，共39循環。以2-ΔΔCt表示細胞中ZnT8 mRNA的相對表達量。②采用Western blotting法檢測各組rMC-1細胞內ZnT8 蛋白。各組細胞繼續培養24 h后，棄培養基后用蛋白酶溶解收集細胞，加入組織蛋白抽提液提取蛋白，BCA法測蛋白濃度；取配制好的10%的膠，以每泳道40 mg蛋白進行電泳分離，電泳條件為80 V 30 min，120 V 1 h，4 ℃下300 mA 2 h轉至PVDF膜上，5% PBS脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，Odyssey Infrared Imaging系統計算細胞中ZnT8蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞活力及凋亡率比較 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞活力分別為0.252±0.034、0.342±0.031、0.513±0.040，組間相比，P均<0.05，說明rMC-1細胞在外源性鋅離子處理后活力下降，EPO治療具有保護作用。

ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞凋亡率分別為60.326%±5.230%、28.268%±3.756%、15.124%±3.521%，組間相比，P均<0.01。

2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞中鋅離子濃度、ZnT8表達比較 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞內鋅離子濃度分別為6.712%±1.251%、4.723%±0.892%、3.428%±0.522%，組間相比，P均<0.05。

CoCl2組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.224±0.038、2.436±0.187，CoCl2+EPO組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.314±0.030、3.082±0.247，正常對照組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.385±0.025、3.583±0.256，組間相比，P均<0.01，說明rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的表達在CoCl2處理后表達下降，在EPO治療后表達升高。

3 討論

鋅是人體內第2豐富的微量元素，并且是維持細胞正常功能的必須元素，在人體代謝中起重要作用，比如酶的合成、胰島素的合成和釋放等，同樣在免疫反應、氧化應激、老化過程中起重要作用。鋅離子豐富表達于視網膜色素上皮、脈絡膜和神經視網膜，在視網膜中鋅離子參與維持正常的視覺功能、調節突觸傳遞和抗氧化應激作用，同時在視網膜生理、病理過程中起重要作用[9]。研究[7]表明，人體鋅離子缺乏會導致的視網膜中抗氧化劑的減少進而導致暗適應的破壞、黃斑變性和白內障等。同時實驗[10]表明，口服補鋅治療對早期糖尿病大鼠視網膜病變具有保護作用，然而在糖尿病視網膜病變晚期，視網膜缺氧條件下，鋅離子的缺乏或超載，均對視網膜細胞具有毒害作用。同時已有許多研究[11,12]表明，細胞內鋅離子蓄積對神經元、膠質細胞和其他細胞有毒害作用。我們實驗也證實了鋅離子蓄積對細胞的毒性作用，即在外源性鋅離子處理后，rMC-1細胞活力下降、細胞凋亡率增加。同時EPO對外源性鋅離子蓄積誘導的細胞毒性具有保護作用，即EPO治療后細胞活力提高、細胞凋亡率顯著減少。

本研究結果表明，低氧環境下rMC-1細胞內的鋅離子濃度增加，同時缺氧狀態下細胞內鋅離子蓄積可能對細胞產生毒性作用，因此缺氧狀態下鋅離子蓄積產生的細胞毒害作用可能為缺氧性視網膜損傷的一個機制。此結果還需進一步實驗驗證。已有研究[3]表明，EPO具有保護缺氧狀態下視網膜神經和血管的作用，EPO可以通過抑制HIF-1α的表達起到抗VEGF的作用、EPO可以通過降低缺氧條件下一些炎癥因子(IL-2、TNF-α等)的表達發揮視網膜保護作用。EPO及其受體表達于Müller細胞上。為此，我們研究低氧狀態下EPO對Müller細胞內鋅離子是否有調控作用。我們的研究表明，EPO治療可顯著性減少低氧狀態下細胞內鋅離子的蓄積，即在低氧狀態下細胞內鋅離子濃度顯著性增加，在EPO治療后細胞內鋅離子顯著降低。綜上，EPO通過降低缺氧狀態下鋅離子蓄積產生的細胞毒性作用，可能為EPO保護缺氧性視網膜病變的其中一個機制。

研究[2]表明，細胞內鋅離子穩態是靠鋅離子轉運蛋白及鋅結合蛋白維持的。鋅離子轉運蛋白主要分為ZnT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)兩大家族，ZnT的作用為轉運細胞質內的鋅離子到細胞外，ZIP的作用與ZnT正好相反，轉運細胞外或細胞核內的鋅離子到細胞質,這些轉運蛋白在鋅離子的調節過程中起重要作用。ZnT8廣泛分布于視網膜中，主要表達于視網膜色素上皮細胞和Müller細胞中，其在調節細胞內鋅離子的動態平衡中起著重要的作用。ZnT8豐富表達于Müller細胞中，其對鋅離子的調控作用是把鋅離子轉移到細胞外或細胞核中，從而降低胞漿內鋅離子濃度，且已有研究[2]表明低氧狀態下Müller細胞內ZnT8表達降低。因此，我們檢測EPO對低氧狀態下ZnT8 mRNA及蛋白水平表達的影響。本研究結果表明，在CoCl2處理后，ZnT8 mRNA及蛋白水平的表達均顯著降低，并且在EPO治療后其表達顯著增加。因此，EPO可以增加低氧狀態下Müller細胞內ZnT8的表達。

綜上所述，EPO對鋅離子蓄積產生的細胞毒害作用如細胞活力降低、細胞凋亡率增加具有保護作用，EPO可減少低氧狀態下rMC-1細胞內鋅離子濃度，其機制可能與增加ZnT8表達有關。本細胞研究結果還需動物體內實驗進一步驗證，其它鋅離子轉運體ZnT3、ZnT6、Zip1、Zip2、Zip3等在低氧模型中是否改變及EPO調節ZnT8的信號通路也需進一步研究。