不同濃度維替泊芬對鼻咽癌細胞株CNE1增殖、侵襲、凋亡的影響及其機制

陳嶸，鄭斯明，蘇年華，左可軍

(1 中山市人民醫院，廣東中山528403；2 中山大學附屬第一醫院)

鼻咽癌細胞常發生于鼻咽部黏膜上皮，發病部位解剖結構較復雜，為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其癌細胞病理分化程度低并且比較容易發生轉移[1]。鼻咽癌高發于北非及東南亞，我國華南地區的發病率也較高，該病的致病因素至今未完全明了，可能與環境因素、遺傳因素和EB病毒感染相關[2]。目前，鼻咽癌的主要治療手段為放射治療，但是大多數初診患者已經發生局部或遠處淋巴結轉移，其療效欠佳，患者治療后可能會發生腫瘤復發及轉移[3]。因此，探尋一種療效顯著、不良反應小的治療方案迫在眉睫。維替泊芬是一種光學增強劑，美國FDA于2000年批準其應用于以脈絡膜血管形成為主的老年黃斑相關疾病的臨床治療。近期多項研究[4]表明，維替泊芬具有殺傷腫瘤細胞的能力，具有良好的抗腫瘤效應。研究[5]表明，維替泊芬可特異性抑制癌蛋白YAP1，并影響腫瘤細胞中眾多基因及信號通路的調控，介導腫瘤細胞生長相關基因及蛋白生成，抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。目前無維替泊芬對鼻咽癌細胞作用的相關研究報道。2018年10月～2019年4月，本研究觀察了不同濃度的維替泊芬對鼻咽癌細胞株CNE1增殖、侵襲、凋亡、細胞周期的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組 CNE1細胞在含100 mg/L鏈霉素、100 mL/L血清和100 kU/L青霉素的DMEM培養基中培養，細胞增殖至密度達80%左右時，胰酶消化并傳代培養。取對數生長期CNE1細胞分為實驗組和對照組，實驗組分別加入1、2、4 μmol/L的維替泊芬，記為A、B、C組，對照組加入等量培養基。

1.2 各組細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。取各組細胞以6×103/孔接種于96孔板，每個濃度設置5個復孔，繼續培養24、48 h后，加入CCK8溶液10 μL，培養箱中孵育4 h，以空白孔為空白組，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。以細胞存活率表示細胞增殖能力。

1.3 各組細胞克隆形成能力觀察 采用細胞克隆形成實驗。取各組細胞以500個/孔接種于6孔板中，于培養箱中繼續培養10 d，去除6孔板中的培養基并用DPBS緩沖液沖洗干凈，4%多聚甲醛固定30 min后沖洗干凈，結晶紫溶液染色30 min，去除染色液后充分清洗干凈，倒置顯微鏡下觀察并計數細胞克隆形成個數(超過50個細胞的細胞團為一個細胞克隆)。以細胞克隆形成個數表示細胞克隆形成能力。

1.4 各組細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室侵襲實驗。Transwell小室經培養基濕潤后包被Matrigel膠，于培養箱中放置30 min備用。取各組細胞重懸于無血清培養基并接種于上室，終體積為200 μL；下室中加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養基，藥物濃度與上室一致。在培養箱中培養24 h后取出小室，甲醇固定30 min，DPBS清洗2遍，加入結晶紫染色1 h，去除染色液后用棉簽擦去殘膠，DPBS洗滌3遍后干燥，100倍光鏡下隨機選擇中央及四周5個視野計數侵襲細胞數，以侵襲細胞數表示細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。取各組細胞以1×106/孔接種于6孔板中，繼續培養24 h后，收集細胞并用PBS清洗3次，充分去除洗滌液后加入100 μL Binding buffer重懸，加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：畫十字門，記錄各組十字門的第四象限細胞百分比。以第四象限細胞百分比表示各組細胞凋亡率。

1.6 各組細胞周期觀察 采用流式細胞術。取各組細胞以1×106/孔接種于6孔板中，繼續培養24 h后，收集細胞并用PBS清洗3次，充分去除洗滌液后加入75%乙醇固定，4 ℃存放24 h，PBS洗滌3次后加入500 μL PI重懸，4 ℃避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 B組及對照組細胞中YAP1、TEAD、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B細胞瘤-2(Bcl-2)、細胞周期素D1(CyclinD1)、髓細胞組織增生蛋白(MYC)、Axl mRNA及蛋白檢測 ①采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA。取B組及對照組細胞繼續培養24 h后，TRIzol裂解并提取細胞總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，以GAPDH為內參，進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列如下：YAP1上游引物為5′-GCCCAGTTATACCTCAGTGTTGTAG-3′，下游引物為5′-GGTCTCCTTCAGGTCAGTACAG-3′；TEAD上游引物為5′-GCCCATGTGCGAGTACCT-3′，下游引物為5′-TCCAGGACGCTGTTCATCA-3′；Caspase-3上游引物為5′-GGCTGAGCTGCCTGTAACTTG-3′，下游引物為5′-TGGCTCTGCCTTCATGGAAC-3′；Bcl-2上游引物為5′-GAGCACAGAAGATGGGAACACT-3′，下游引物為5′-AGGTGCATGGATTTACTCAGTATC-3′；Cyclin D1上游引物為5′-CTGGGTCTGTGCATTTCTGGTT-3′，下游引物為5′-CTGCTGGAAACATGCCGGTTA-3′；MYC上游引物為5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′，下游引物為5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；Axl上游引物為5′-CCACCTTTCGGGCCATGTT-3′，下游引物為5′-GAGGCACCAGAGTCCACACT-3′；GAPDH上游引物為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游引物為5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。建立20 μL qRT-PCR擴增體系，包含TB Green混合物10 μL，DEPC水6.4 μL，cDNA 2 μL和相關基因上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環。用2-ΔΔCt表示細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對表達量。②采用Western Blotting法檢測細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白。取B組及對照組細胞繼續培養24 h后，充分洗滌后用細胞裂解液4 ℃條件下充分裂解20 min，提取全細胞蛋白并用Bradford法測定蛋白濃度。選擇合適濃度的SDS-PAGE膠，每個電泳通道加入30 μg蛋白，80 V恒壓電泳0.5 h后，120 V電泳1 h，250 mA恒流濕轉法轉膜，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶溶液中封閉1.5 h，分別將PVDF膜孵育相應一抗溶液，4 ℃搖床搖晃過夜，TBST溶液洗滌3次(10 min/次)，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST溶液漂洗二抗3次(10 min/次)，瀝干后加入ECL發光液，于Tannon成像系統中顯影，蛋白灰度值采用Image J軟件計算。以目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 A、B、C及對照組細胞培養24 h時細胞存活率分別為85.27%±0.63%、74.18%±1.01%、57.67%±0.92%、100.00%±0.42%，組間相比，P均<0.05；A、B、C及對照組細胞培養48 h時細胞存活率分別為70.35%±0.61%、59.33%±1.27%、41.39%±0.46%、100.00%±0.85%，組間相比，P均<0.05；A、B、C組細胞在培養48 h時的細胞存活率，與24 h時相比，P均<0.05。

2.2 各組細胞克隆形成能力比較 A、B、C及對照組細胞克隆形成個數分別為183.67±12.92、118.67±10.50、47.33±5.31、253.67±8.18個，組間相比，P均<0.05。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 A、B、C及對照組細胞侵襲細胞數分別為44.67±2.87、28.67±4.11、16.67±3.68、56.67±5.31個，組間相比，P均<0.05。

2.4 各組細胞凋亡率比較 A、B、C及對照組細胞凋亡率分別為14.52%±1.03%、26.56%±2.10%、38.64%±1.42%、5.31%±0.77%，組間相比，P均<0.05。

2.5 各組細胞周期比較 A組G2/M、S、G0/G1期細胞分別為15.46%±1.74%、42.37%±2.69%、42.17%±1.73%，B組G2/M、S、G0/G1期細胞分別為8.39%±0.77%、34.48%±0.57%、57.13%±0.39%，C組G2/M、S、G0/G1期細胞分別為3.82%±1.89%、26.16%±0.81%、70.02%±1.42%，對照組G2/M、S、G0/G1期細胞分別為21.52%±0.75%、53.14%±1.31%、25.34%±0.95%，各細胞周期比例組間相比，P均<0.05。

2.6 B組及對照組細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA及蛋白相對表達量比較 ①B組細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對表達量分別為0.37±0.12、0.56±0.17、0.35±0.25、0.43±0.29、0.48±0.27、0.39±0.35、0.35±0.71，對照組細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相對表達量分別為1.00±0.33、1.00±0.67、1.00±0.14、1.00±0.28、1.00±0.81、1.00±0.33、1.00±0.11，兩組相比，P均<0.05。②B組細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相對表達量分別為0.51±0.45、0.44±0.31、0.42±0.23、0.61±0.09、0.39±0.41、0.52±0.38、0.48±0.21，對照組細胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相對表達量分別為1.00±0.56、1.00±0.82、1.00±0.73、1.00±0.32、1.00±0.34、1.00±0.14、1.00±0.29，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

鼻咽癌是人類常見惡性腫瘤之一，復發及癌細胞轉移是患者死亡的主要原因，目前治療手段有限。近年來，惡性腫瘤的分子靶向精準治療取得了較大進步。多項研究[6]表明，Hippo通路參與了腫瘤細胞的發生發展。Hippo通路調節著細胞生存，從而影響組織及器官發育。Hippo通路中核心轉錄共刺激因子YAP1可通過磷酸化及去磷酸化調節并參與細胞中一系列的轉錄活動[7]。多項研究[8]表明，YAP1在多種惡性腫瘤細胞中過表達，并且調節著癌細胞增殖、生存及侵襲能力。Song等[7]研究發現，鼻咽癌患者的鼻咽組織中YAP1表達量遠遠高于健康供者，提示癌蛋白YAP1是鼻咽癌潛在的治療新靶點，為靶向精準治療藥物開發拓展新方向。本研究結果顯示，加入不同濃度的維替泊芬后，鼻咽癌細胞株CNE1的增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力顯著下降，細胞凋亡率升高，阻滯其生長周期，且維替泊芬對CNE1細胞的調節作用存在一定的濃度依賴性。

Brodowska等[9]發現，YAP可以與TEAD形成TEAD-YAP復合物，共同調節下游原癌基因c-myc、Axl以及細胞遷移和血管生成因子等表達，維替泊芬可抑制YAP-TEAD復合物的形成并阻斷下游因子的表達，從而殺傷視網膜母細胞瘤細胞。研究[10]顯示，YAP可通過TEAD直接激活Pik3cb表達并誘導PI3K轉錄，進而活化PI3K/AKT通路，YAP通過AKT途徑增強肝癌細胞的增殖能力。進一步研究[11]發現，AKT抑制劑可抑制YAP1的活性并減弱結締組織生長因子的翻譯活性，激活肝癌細胞程序性細胞死亡并抑制腫瘤細胞的生存能力。Wei等[12]發現，YAP1抑制劑維替泊芬可促進胰腺癌細胞凋亡，其抗胰腺癌活性與腫瘤細胞中的Bcl-2蛋白表達升高相關，進一步研究發現胰腺癌細胞中多種蛋白水解酶對靜息狀態的caspase-3酶原進行水解，激活caspase-3剪切酶，加強維替泊芬殺傷腫瘤細胞能力。研究[13]顯示，YAP1抑制劑維替泊芬可促進前列腺癌細胞及胰腺癌細胞的凋亡，同時抑制腫瘤細胞的生長周期，其機制與抗凋亡蛋白Bcl-2、MYC、caspase-3、Cyclin D1表達有關。本研究結果同樣表明，維替泊芬可通過激活及裂解caspase-3并抑制Bcl-2蛋白表達，誘導鼻咽癌細胞凋亡。

本研究結果顯示，維替泊芬抑制鼻咽癌細胞生長周期進展，將CNE1細胞阻滯于G0/G1期，減少S期及G2/M期比例，阻滯細胞增殖。前期研究[14]發現，維替泊芬作用于白血病細胞后可抑制YAP和TEAD蛋白的相互作用，促進YAP和TEAD蛋白的降解，并且抑制CyclinD1蛋白的翻譯活動，將白血病細胞周期阻滯于G0/G1期，降低S期和G2/M期的細胞數，抑制白血病細胞增殖率。本研究發現，維替泊芬可減弱鼻咽癌細胞中的YAP和TEAD蛋白復合體的相互作用，抑制其轉錄及翻譯水平，促進蛋白質降解。同時減少細胞中CyclinD1蛋白表達量，抑制鼻咽癌細胞從G1期向S期轉化，阻滯細胞周期于G0/G1期，降低鼻咽癌細胞中DNA合成量，從而抑制鼻咽癌細胞的生存及增殖能力。

綜上所述，1、2、4 μmol/L的維替泊芬均可抑制CNE1細胞的增殖、侵襲能力，誘導細胞凋亡，阻滯生長周期，且調節作用與維替泊芬的濃度有關；維替泊芬調控CNE1細胞增殖、侵襲、凋亡和細胞周期的作用機制可能與抑制YAP1及其下游因子的表達有關。本研究一定程度上為鼻咽癌在分子靶向精準治療方面提供了理論支撐，為鼻咽癌患者的治療提供了新選擇及新希望。