黃芩素和漢黃芩素聯合應用對恩替卡韋耐藥乙型肝炎病毒的抑制作用及最佳配比觀察

思蘭蘭，李樂，陳容娟，柏兆方，牛明，王伽伯，蘭金初，徐東平，劉妍

(1 中國人民解放軍總醫院第五醫學中心，北京100039；2 北京市鼓樓中醫醫院)

乙型肝炎病毒(HBV)感染相關疾病嚴重危害人類健康，持續病毒復制增加了肝硬化和肝癌的風險。目前臨床上治療HBV感染的藥物主要有干擾素和核苷(酸)類似物(NAs)。這些藥物給患者帶來益處的同時也存在局限性。研究[1]顯示，干擾素需要注射，副作用大且僅有約30%的乙肝患者對其敏感。臨床上廣泛應用的口服抗病毒藥NAs不能清除HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)[2]，因此需要長期服藥，而隨之產生的病毒耐藥問題也是當前困擾臨床的難題[3]。研究者一直在努力探索更多安全有效的抗HBV藥物和方法，除了開發更新型的化學藥物，許多中草藥也被發現具有抗HBV作用[4～6]。這些中草藥中含有的化學結構類型包括黃酮類、苯丙素類、萜類、生物堿、醌類和多糖等，與目前臨床上應用的以NAs為主的抗HBV藥物的單一結構類型相比，更具多樣性，抗病毒的機制也各不相同，這不僅有助于開發抗HBV新藥，并且對發展聯合用藥、提高療效、減小副作用和耐藥突變的發生都有重要意義[7,8]。本課題組前期研究[9,10]表明，新型中藥復方制劑肅毒星可通過多分子、多靶點、多通路的方式抑制HBV復制。肅毒星的成分分析顯示，其含有氧化苦參堿、苦參堿、黃芩素、漢黃芩素等25種主要成分，其中黃芩素和漢黃芩素單獨使用及聯合使用都有很好的抗野生HBV和恩替卡韋(ETV)耐藥HBV的作用。本研究觀察了黃芩素、漢黃芩素及其聯合應用對ETV耐藥HBV的抑制作用及最佳配比，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 黃芩素、漢黃芩素藥物濃度選擇及細胞分組 采用CCK8法觀察黃芩素、漢黃芩素對ETV耐藥HBV的毒性作用。將對數生長期的HepG2.A64細胞[11]以每孔2×104個接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，分別單獨加入不同濃度的黃芩素(0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)和漢黃芩素(0.75、1.5、3、6、12、24、48、96、192、384 μmol/L)，記為實驗組。隔天換液1次，繼續培養96 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液繼續培養2 h。以空白孔為空白組，以不加藥物的孔為對照組，酶聯免疫檢測儀檢測在波長450 nm處各孔的吸光度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。結果顯示，黃芩素在16 μmol/L、漢黃芩素在12 μmol/L時的細胞存活率大于90%，故本研究選擇黃芩素的最高濃度為16 μmol/L、漢黃芩素的最高濃度為12 μmol/L進行后續實驗。

取HepG2.A64細胞，分為黃芩素組、漢黃芩素組、聯用藥物組和對照組。黃芩素組分別加入4、8、16 μmol/L的黃芩素，記為B4、B8、B16組。漢黃芩素組分別加入3、6、12 μmol/L的漢黃芩素，記為W3、W6、W12組。聯用藥物組的第一部分分別加入相同濃度(4 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B4+W3、B4+W6、B4+W12組；聯用藥物組的第二部分分別加入相同濃度(8 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B8+W3、B8+W6、B8+W12組；聯用藥物組的第三部分分別加入相同濃度(16 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B16+W3、B16+W6、B16+W12組。對照組加入等量DMEM培養基。

1.2 各組細胞上清HBV DNA、HBsAg檢測 取各組細胞以0.5×105/孔鋪種于48孔板，繼續培養96 h后，收集細胞上清。①采用PCR-熒光探針“一管法”檢測細胞上清HBV DNA。按照乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒說明書進行定量PCR反應體系配制：細胞上清3 μL+核酸釋放劑3 μL+PCR-mix 32 μL，吹打混勻3～5次，瞬時離心，然后使用SLAN96P熒光定量檢測儀定量檢測HBV DNA滴度。擴增程序為：37 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、61 ℃ 30s，40個循環。根據檢測結果計算細胞上清HBV DNA抑制率。細胞上清HBV DNA抑制率=100%-(各組細胞上清HBV DNA滴度/對照組細胞上清HBV DNA滴度)×100%。②采用雙抗體夾心法檢測細胞上清HBsAg。取細胞上清50 μL，加入預先包被好的酶聯板，實驗同時設置空白對照孔、陰性對照孔、陽性對照孔，每孔分別加入酶結合物50 μL(空白對照孔不加)混勻，貼上不干膠條，37 ℃孵育60 min，洗板5次，然后加入顯色液，37 ℃孵育15 min顯色，最后加入終止液終止顯色反應，使用Synergy H4全功能酶標儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度(OD)值，計算細胞上清HBsAg抑制率。細胞上清HBsAg抑制率=100%-(各組細胞上清HBsAg的OD值/對照組細胞上清HBsAg的OD值)×100%。

1.3 各組細胞內HBV總DNA和HBV cccDNA的檢測 取各組細胞以1.5×105/孔鋪種于12孔板，繼續培養96 h后，收集培養的細胞進行計數，收集時每孔細胞計數需要達到3×105～5×105個。按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書提取細胞總DNA，PSAD酶消化，按照95 ℃ 3 min、50 ℃ 15 s、30 ℃ 15 s、20 ℃ 10 min的程序進行跨缺口滾環擴增(RCA)[12]。引物序列如下：RCA1正向引物為5′-AATCCTCACAATACC-3′，RCA1反向引物為5′-ACCTATTCTCCTCCC-3′；RCA2正向引物為5′-CCTATGGGAGTGGGC-3′，RCA2反向引物為5′-CCTTTGTCCAAGGGC-3′；RCA3正向引物為5′-ATGCAAC TTTTTCAC-3′，RCA3反向引物為5′-CTAGCAGAGCTTGGT-3′；RCA4正向引物為5′-TAGAAGAAGAACTCC-3′，RCA4反向引物為5′-GGGCCCACATATTGT-3′。以RCA擴增產物為模板，熒光定量PCR法檢測細胞內HBV總DNA、HBV cccDNA的拷貝數[13]。反應條件：60 ℃ 10 s，94 ℃ 3 min、94 ℃ 15 s、58 ℃ 45 s(40個循環)。根據細胞內HBV總DNA、HBV cccDNA的拷貝數，計算細胞內HBV總DNA抑制率。細胞內HBV總DNA抑制率=100%-(各組HBV總DNA拷貝數/對照組HBV總DNA拷貝數)×100%。細胞內HBV cccDNA抑制率=100%-(各組HBV cccDNA拷貝數/對照組HBV cccDNA拷貝數)×100%。

2 結果

2.1 各組細胞上清HBV DNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對照組細胞上清HBV DNA抑制率分別為29.01%±3.60%、61.79%±0.09%、73.59%±2.65%、30.45%±1.26%、62.65%±0.05%、67.22%±3.93%、49.81%±1.36%、63.87%±4.01%、73.64%±0.29%、70.05%±1.15%、70.99%±0.42%、79.16%±1.54%、79.18%±0.53%、80.57%±1.60%、83.00%±2.31%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯用藥物組細胞上清HBV DNA抑制率與對照組相比，P均<0.05；聯用藥物組細胞上清HBV DNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均<0.05。聯用藥物組B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為0.884、0.869、0.960、0.954、0.828、0.905、0.970、0.894、0.909，其中B8+W6組表現為拮抗作用，其余各組均為相加作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.2 各組細胞上清HBsAg抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對照組細胞上清HBsAg抑制率分別為20.46%±0.92%、30.52%±6.59%、39.46%±2.63%、14.13%±2.90%、26.42%±4.74%、38.53%±1.32%、19.87%±0.13%、23.81%±1.32%、36.29%±5.01%、26.56%±1.15%、27.44%±0.66%、48.68%±3.29%、42.55%±2.30%、39.37%±1.19%、52.87%±3.42%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯用藥物組細胞上清HBsAg抑制率與對照組相比，P均<0.05；聯用藥物組細胞上清HBsAg抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，其中B8+W12組與B8組、W12組相比，B16+W3組與B16組、W3組相比，B16+W12組與B16組、W12組相比，P均<0.05；其余聯用藥物組與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均>0.05。聯用藥物組B8+W12、B16+W3、B16+W12的Q值分別為0.850、0.886、0.842，其中B8+W12、B16+W3組為相加作用，B16+W12組為拮抗作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.3 各組細胞內HBV總DNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對照組細胞內HBV總DNA抑制率分別為28.14%±0.44%、44.89%±0.81%、58.70%±7.36%、13.50%±0.63%、43.61%±0.89%、68.08%±1.62%、37.89%±0.36%、60.41%±3.27%、67.03%±1.67%、58.94%±0.32%、64.47%±5.54%、73.68%±7.53%、76.05%±2.68%、80.47%±2.18%、87.97%±1.24%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯用藥物組細胞內HBV總DNA抑制率與對照組相比，P均<0.05；聯用藥物組細胞內HBV總DNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均<0.05。聯用藥物組B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為1.001、1.016、0.870、1.126、0.935、0.894、1.183、1.049、1.013，其中B16+W3組表現為協同作用，其余各組均為相加作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.4 各組細胞內HBV cccDNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對照組細胞內HBV cccDNA抑制率分別為31.06%±2.89%、47.86%±6.79%、54.67%±3.92%、43.84%±2.11%、54.84%±1.78%、68.86%±2.80%、55.00%±3.30%、31.66%±1.40%、34.05%±4.85%、65.12%±3.41%、49.39%±0.95%、44.42%±2.36%、72.42%±4.71%、68.15%±2.46%、72.05%±0.34%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯用藥物組細胞內HBV cccDNA抑制率與對照組相比，P均<0.05；聯用藥物組細胞內HBV cccDNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，其中B16+W3組與B16組、W3組相比，B16+W6組與B16組、W6組相比，B16+W12組與B16組、W12組相比，P均<0.05；其余聯用藥物組與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均>0.05。聯用藥物組B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為0.972、0.857、0.839，其中B16+W3、B16+W6組為相加作用，B16+W12組為拮抗作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

3 討論

近年來，隨著抗病毒治療技術的不斷發展，聯合抗病毒治療已經成為臨床常用的一種HBV治療方案，且聯合治療顯示出一定的優勢。我們前期研究[10]發現，黃芩素和漢黃芩素是新型中藥復方抗病毒制劑——肅毒星注射液中的兩種主要組成成分，這兩種化合物單獨或以1∶2的比例聯合應用對野生型HBV及ETV耐藥HBV有很好的抑制作用。黃芩素，也叫黃芩黃素或黃芩苷元，是從黃芩根中提取的一種具有生物活性的黃酮類化合物。近年越來越多的研究[10,15]發現，黃芩素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保護肝臟、保護心腦血管、抗炎、抗氧化、降血糖等多種生物學功能。漢黃芩素，也是從黃芩根中分離提取出來的一種黃酮類化合物，它是黃芩的主要有效成分之一。目前已有大量研究[10,16]證明，漢黃芩素具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化及抗HBV作用等功能。目前這兩個藥物聯合抗HBV的作用研究鮮見報道，同時兩種化合物對ETV耐藥HBV cccDNA的相關研究尚未見報道。本研究旨在明確兩者聯合對ETV耐藥HBV作用的最佳聯合比例及其對HBV cccDNA的作用效果。

本研究選擇細胞存活率>90%的藥物濃度進行后續實驗。為了尋找最佳的聯合抗病毒作用比例，我們選擇4、8、16 μmol/L的黃芩素和3、6、12 μmol/L的漢黃芩素分別進行兩兩聯合抗病毒實驗。研究結果顯示，黃芩素組對HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為29.01%～73.59%、20.46%～39.46%，漢黃芩素組對HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為30.45%～67.22%、14.13%～38.53%，聯用藥物組對HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為49.81%～83.00%、19.87%～52.87%，聯合抑制作用的效果更明顯。Guo等[17]使用漢黃芩素對野生型HBV細胞株HepG2.2.15細胞進行研究，發現2～5 μg/mL(約7～18 μmol/L)的漢黃芩素對HBsAg的抑制率為45%～60%，對HBV DNA的抑制率為30%～40%。我們單獨使用漢黃芩素對HBsAg抑制作用與之一致，對HBV DNA的抑制作用則優于Guo的研究。以往對黃芩素、漢黃芩素抗HBV研究中未見對HBV總DNA、HBV cccDNA兩個指標進行過評價，本研究結果顯示，聯用藥物組對細胞內HBV總DNA、HBV cccDNA的抑制效果較黃芩素組、漢黃芩素組好，我們的結果可為以后研究者探索這兩個藥物抗HBV總DNA、HBV cccDNA的作用提供很好的參考。

綜上所述，中藥復方制劑肅毒星的兩個重要組分黃芩素、漢黃芩素對ETV耐藥HBV有很好的抑制作用，且聯合用藥抑制作用優于單獨用藥。同時，我們還首次證明黃芩素、漢黃芩素對HBV cccDNA有抑制作用，且聯合用藥的抑制作用較單獨用藥的抑制作用明顯。本研究結果對于強效NAs的長期應用帶來的耐藥問題及HBV cccDNA清除的乙肝功能性治愈有著很好的臨床用藥參考價值和較好的臨床應用前景。