RASSF1A基因在人乳腺癌細胞株MCF-7中的表達及對細胞增殖凋亡、體內成瘤能力的影響觀察

李一，黃婷，楊麟瀚，吳池華

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院，成都 610072)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，是所有腫瘤死亡的第五大原因[1]。世界衛生組織的最新統計數據[2]顯示，截至2018年全球乳腺癌新發病例約為138萬例，占所有新發腫瘤病例的23%，我國每年新發乳腺癌病例和相關死亡人數分別占世界的12.2%和9.6%，并且發病率以每年2%的趨勢增長，到2021年中國估計將有250萬人患乳腺癌。雖然早期檢查和診斷技術的改進以及手術和綜合輔助治療的進步已經顯著改善了患者的預后，但乳腺癌患者的總體生存率仍然不理想[3，4]。乳腺癌的發病機制仍未完全明確，但隨著對乳腺癌生物學機制的深入理解，其分子靶向治療逐漸成為可能[5]。Ras相關區域家族1異構體A(RASSF1A)屬于RAS效應子家族，其編碼一種支架蛋白，通過促進多種效應蛋白復合物的組裝來調節多種細胞凋亡和細胞周期檢查點通路[6]。研究[7～10]顯示，RASSF1A基因在多種腫瘤中被報道為抑癌基因，包括非小細胞肺癌、結直腸癌和胃癌等，在乳腺癌中RASSF1A基因發生高甲基化，可能是乳腺癌的潛在診斷標志物。本研究在細胞水平觀察了RASSF1A基因對乳腺癌細胞MCF-7增殖、凋亡和體內成瘤能力的影響，探討RASSF1A基因在乳腺癌發生發展中可能的作用機制，為RASSF1A成為治療乳腺癌潛在藥物靶點提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、儀器及裸鼠 人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC細胞庫；RASSF1A過表達慢病毒oe-RASSF1A、空白載體慢病毒vector購自上海漢恒生物科技有限公司；RPMI1640培養基和FBS購自美國Gibco公司；培養瓶和培養板等購自美國Coring公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄和qRT-PCR試劑盒等購自日本TaKaRa公司；MTS購自北京百奧萊博生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)抗體(ab32089)、磷酸化PI3K(pPI3K)抗體(ab127617)、蛋白激酶B(AKT)抗體(ab179463)和磷酸化AKT(pAKT)抗體(ab38449)購自英國abcam公司；裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 細胞培養、慢病毒載體感染及分組 取MCF-7細胞培養在含10%FBS的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞融合度為90%左右時，按1∶2的比例進行傳代，取生長狀態良好的細胞用于實驗。取對數生長期的MCF-7細胞以1.5×105個/孔鋪至6孔板中，細胞貼壁后將RASSF1A過表達慢病毒oe-RASSF1A和空白載體慢病毒vector與含有5 μg/mL病毒感染增強液的無血清培養基混勻后加入各組細胞中，分別記為oe-RASSF1A組、vector組。

1.3 兩組細胞中RASSF1A mRNA的檢測 采用qRT-PCR法。兩組細胞繼續培養72 h后，根據RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，以β-actin為內參，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行熒光定量PCR反應。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。引物序列如下：RASSF1A正向引物為5′-GTAATGGAAATTTGGGTGTAGGGAT-3′,反向引物為5′-CTAACAACCCAAAATAACAAAACCA-3′；β-actin引正向引物為5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,反向引物為5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中RASSF1A mRNA的相對表達量。

1.4 兩組細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取兩組細胞以每孔3 000個接種于96孔板中，每組設置5個復孔，放置在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。在培養24、48、72、96 h時，更換100 μL新鮮培養基，并加入20 μL MTS檢測試劑，37 ℃孵育2 h后，采用酶標儀檢測樣品在490 nm處的吸光度(OD)值，以OD值表示細胞增殖能力。實驗重復3次，取平均值。

1.5 兩組細胞周期觀察 采用流式細胞實驗。兩組細胞繼續培養72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計數，取1×106個細胞加入預冷的70%酒精4 ℃固定12 h，重懸于500 μL染色緩沖液中，然后分別加入250 μL PI和10 μL RNase A染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細胞儀觀察細胞周期，計算各細胞周期比例。實驗重復3次，取平均值。

1.6 兩組細胞凋亡率測算 采用流式細胞實驗。兩組細胞繼續培養72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計數，取1×106個細胞重懸于500 μL染色緩沖液中，然后分別加入5 μL FITC和5 μL PI染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細胞儀測算細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.7 兩組細胞體內成瘤能力觀察 采用皮下移植瘤實驗。兩組細胞繼續培養72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計數，取1×107個細胞重懸于100 μL PBS中。取4周齡雌性裸鼠10只，分成2組，分別在右側腋下注射重懸后的兩組細胞，常規飼養4周后處死裸鼠，解剖瘤體并稱重，以瘤體重表示細胞體內成瘤能力。所有操作均符合動物倫理學。

1.8 兩組細胞中RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白檢測 采用Western Blotting法。兩組細胞繼續培養72 h后，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，完全裂解后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，煮沸變性后進行SDS電泳，蛋白經濕轉移至PVDF膜上，室溫經8%牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，二抗室溫孵育2 h，ECL化學發光法曝光條帶，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞中RASSF1A mRNA相對表達量比較 oe-RASSF1A組細胞中RASSF1A mRNA相對表達量為13.25±3.20，vector組細胞中RASSF1A mRNA相對表達量為1.00±0.03，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 oe-RASSF1A組細胞在培養24、48、72、96 h時的OD值分別為0.36±0.02、0.53±0.06、0.74±0.13、0.91±0.07，vector組細胞在培養24、48、72、96 h時的OD值分別為0.35±0.03、0.62±0.14、0.95±0.08、1.34±0.21，其中，在培養72、96 h時兩組的OD值相比，P均<0.05。

2.3 兩組細胞周期比較 oe-RASSF1A組細胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分別為60.02%±3.21%、18.30%±2.31%、22.11%±1.03%，vector組細胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分別為63.67%±4.16%、21.04%±2.65%、15.32%±2.52%，其中oe-RASSF1A組細胞處于G2/M期的比例與vector組相比，P<0.05。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 oe-RASSF1A組細胞凋亡率為24.38%±5.80%，vector組細胞凋亡率為4.25%±0.92%，兩組相比，P<0.05。

2.5 兩組細胞體內成瘤能力比較 注射oe-RASSF1A組細胞的裸鼠成瘤的瘤體重為63.29±14.03 mg，注射vector組細胞的裸鼠成瘤的瘤體重為104.58±17.52 mg，兩組相比，P<0.05。

2.6 兩組細胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白相對表達量比較 oe-RASSF1A組細胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相對表達量分別為8.67±1.32、0.86±0.21、0.26±0.15、0.91±0.11、0.30±0.07，vector組細胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相對表達量分別為1.05±0.04、1.00±0.00、1.01±0.01、1.04±0.04、1.00±0.00，其中，兩組細胞RASSF1A、pPI3K、pAKT蛋白相對表達量相比，P均<0.05。

3 討論

乳腺癌是一種起源于乳腺導管上皮或乳腺小葉的惡性腫瘤，其發病率占女性所有腫瘤的30%，常見發病年齡為20～59歲之間，其死亡率占女性腫瘤相關死亡原因的第一位，已經成為全球范圍內的公共衛生問題[11]。乳腺癌是一組具有不同臨床和組織學形式的異質性疾病，雖然對其發病機理在不斷的研究，但是其致病機制尚未完全闡明，進一步在分子水平了解其發生發展機制，尋找有效的藥物作用靶點，對更好的治療乳腺癌具有重要的意義。目前最常用于對抗乳腺癌的策略包括手術切除病灶、放射治療、輔助化療、激素治療和靶向治療。近年來，乳腺癌的診斷和治療取得了很大進展，尤其是乳腺癌的外科治療，但是乳腺癌的復發和轉移率很高，手術對于晚期患者治療效果有限[3,12]。紫杉醇、雌激素受體的部分激動劑他莫昔芬和多柔比星等化療藥物均是治療乳腺癌的有效藥物，但在對抗乳腺癌時最大的挑戰是腫瘤細胞的化學抗性，化療藥物對乳腺癌晚期患者治療效果不佳[4,13]。目前乳腺癌治療的主要研究方向是靶向藥物治療，其毒副作用較低、安全性較高，曲妥珠單抗、拉帕替尼和貝伐單抗等靶向藥物均取得了顯著的療效[5]，但是乳腺癌患者的預后并未達到理想的效果，因此開發新的有效分子靶向藥物非常關鍵。

RASSF1A基因位于染色體3p21.3上，廣泛表達于各種正常組織，而在腫瘤組織中常表達缺失，是一種抑癌基因。研究[14]顯示，RASSF1A基因的耗竭是腫瘤起始和進展的基礎。RASSF1A是RASSF(RAS關聯結構域)家族成員之一，可與活化的K-RAS形成內源性復合物，但是RASSF1A沒有酶活性，充當K-RAS調節的支架，將K-RAS連接到多種信號傳導通路進行調節[15]。RASSF1A屬于RASSF家族中研究較多的成員，在非小細胞肺癌、結直腸癌等人類腫瘤細胞中觀察到RASSF1A基因發生表觀遺傳沉默[7，8]。已報道的研究[16]中，RASSF1A基因可刺激有絲分裂停滯、DNA修復和細胞凋亡，并控制細胞周期和細胞遷移。研究[17]顯示，RASSF1A基因在正常乳腺細胞中表達，在正常乳腺組織中顯示8%的啟動子高甲基化，而在乳腺癌組織中高達56%的啟動子發生高甲基化，RASSF1A發生DNA甲基化而表達降低在乳腺癌中較為常見，越來越多的研究表明RASSF1A和乳腺癌密切相關。本研究采用慢病毒技術增加乳腺癌細胞株MCF-7中RASSF1A的表達，觀察RASSF1A對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，結果發現RASSF1A在體外抑制MCF-7細胞的增殖活性，誘導細胞周期阻滯在G2/M期，并促使細胞發生凋亡，在體內抑制MCF-7細胞的成瘤能力，表明RASSF1A通過調控腫瘤細胞的增殖和凋亡參與了乳腺癌的發生發展。

已經觀察到RASSF1A對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，其具體的作用機制需進一步研究。研究[18]發現，RASSF1A是RAS效應因子，在K-RAS的影響下，RASSF1A可以結合凋亡調控相關蛋白MOAP-1，MOAP-1通過結合并激活促凋亡執行因子BAX發揮作用。RASSF1A還結合MST(Hippo)激酶以將K-RAS連接到Hippo信號途徑[19]。此外RASSF1A可通過引起鳥嘌呤核苷酸交換因子1(GEF-H1)、RhoB失活發揮功能[20]。K-RAS引起Ras癌基因突變的激活，活化的RAS被認為主要通過結合和激活三種主要類型的促有絲分裂效應蛋白：RAF激酶、PI3K和RALGEF家族來發揮作用，以刺激促生長和存活信號途徑[21]。其中PI3K的激活導致促有絲分裂脂質的刺激和AKT信號途徑的激活。研究[22]顯示，PI3K/AKT信號途徑是調控腫瘤增殖和凋亡的重要通路之一，在乳腺癌中PI3K/AKT信號途徑異常激活，可作為抗腫瘤藥物治療乳腺癌抑制信號通路之一[23]。Li等[24]在有關肝細胞肝癌的研究中報道，RASSF1A通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路增強自噬。我們推測，RASSF1A可能通過調控PI3K/AKT信號通路發揮抑制細胞增殖和促進凋亡的作用。本研究結果顯示，過表達RASSF1A后，MCF-7細胞中PI3K和AKT總蛋白無明顯變化，發生磷酸化作用的pPI3K和pAKT蛋白表達降低，表明RASSF1A可能通過抑制PI3K/AKT信號通路而在乳腺癌中發揮重要功能。

綜上所述，RASSF1A可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡。RASSF1A在乳腺癌中為抑癌基因，具有成為乳腺癌治療藥物靶點的潛力。